一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法技术

本发明专利技术提供了一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法，涉及伪狂犬病病毒检测技术领域。本发明专利技术的检测伪狂犬病病毒的核酸组合其包括根据伪狂犬病病毒gB基因的保守序列进行设计得到的第一引物对和第一探针，其中，第一引物对包括碱基序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示。该核酸组合能够在数字PCR平台上对狂犬病病毒进行快速简便的检测，可对低狂犬病病毒含量的样品实现检出结果，避免漏检发生，其具有灵敏度高、特异性强、检出率高等特点。

Nucleic acid combination for detecting pseudorabies virus and its application, reagent kit and method

The invention provides a nucleic acid combination for detecting pseudorabies virus, an application thereof, a kit and a method thereof, and relates to the technical field of pseudorabies virus detection. The nucleic acid detection of pseudorabies virus combination comprising the first primer design obtained and the first probe, which according to the conserved sequence of the gB gene of pseudorabies virus, the first primer pair including sequence primers respectively such as SEQ ID and SEQ NO.1 ID NO.2 shows, the base sequence of the first probe as shown in SEQ ID NO.3. The combination of nucleic acid can make rapid and simple detection of rabies virus in the digital PCR platform, on the low content of rabies virus samples to achieve the detection results, to avoid detection, it has the advantages of high sensitivity, strong specificity, high detection rate.

【技术实现步骤摘要】
一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法
本专利技术涉及伪狂犬病病毒检测
，具体而言，涉及一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法。
技术介绍
目前，伪狂犬病病毒(pseudorabies,PRV)属疱疹病毒科(Herpesvirdae)a-疱疹病毒亚科(Alpherpesvirinae)，是一种以怀孕母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎，新生仔猪发热、神经症状、麻痹、衰竭死亡为特征的传染病，其死亡率可达100％。伪狂犬病是危害养猪业最严重的传染病之一，给养猪业造成了巨大的经济损失，该病在我国广泛存在并引发巨大损失。目前核酸方面的检测方法主要为传统PCR，荧光定量PCR以及核酸杂交技术等。定量或者半定量的PCR方法已经有许多的研究报道，往往也显示出不错的效果。然而，针对伪狂犬病病毒的核酸检测，很大程度上依赖于样品的采集部位。如采集样品刚好在扁桃体，三叉神经节，鼻粘膜等病毒含量高的部位则能使得检测顺利，检出率高。但是，在实际的检测中，不是所有时候都是检测者亲自采样，一些部位如三叉神经节也是很难精准采集的，若检测时使用的是血液等病毒含量少的样品，就有可能会出现漏检。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合，该核酸组合包括检测伪狂犬病病毒的引物和探针，利用数字PCR技术检测出样品中低含量的伪狂犬病病毒，避免漏检。本专利技术的第二目的在于提供上述检测伪狂犬病病毒的核酸组合在检测伪狂犬病病毒中的应用，提高检测的灵敏性和特异性，避免漏检。本专利技术的第三目的在于提供一种检测伪狂犬病病毒的试剂盒，该试剂包括上述核酸组合，该试剂盒可用于检测低伪狂犬病病毒含量的样品，避免漏检，其具有灵敏性好、特异性强、检测速度快、操作方便等特点。本专利技术的第四目的在于提供一种检测伪狂犬病病毒的方法，该检测方法以上述的核酸组合作为检测基础，结合数字PCR技术，可对伪狂犬病病毒含量的样品进行检测，具有灵敏性高、特异性强特点。本专利技术的实施例是这样实现的：一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合，其包括第一引物对和与第一引物对相对应的第一探针，第一引物对包括碱基序列分别如SEQIDNO.1-2所示的引物，第一探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示，第一探针的5’端的荧光报告基团为HEX或VIC，第一探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。上述所述的检测伪狂犬病病毒的核酸组合在检测伪狂犬病病毒中的应用。一种检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其包括上述的检测伪狂犬病病毒的核酸组合。一种检测伪狂犬病病毒的方法，其包括：往PCR体系中加入第一引物对和与第一引物对相对应的第一探针；将PCR体系形成微滴，并进行微滴数字PCR；其中，第一引物对包括碱基序列分别如SEQIDNO.1-2所示，第一探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示，第一探针的5’端的荧光报告基团为HEX或VIC，第一探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。本专利技术实施例的一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法的有益效果是：本专利技术的检测伪狂犬病病毒的核酸组合以基于数据PCR平台，根据伪狂犬病病毒的gB基因的保守序列进行设计，该核酸组合包括碱基序列分别如SEQIDNO.1-2所示的引物的第一引物对和碱基序列如SEQIDNO.1-2所示的第一探针，这样，该核酸组合可在数字PCR平台上通过对gB基因的检测，实现对伪狂犬病病毒的检测，在检测的过程中避免漏检，提高检出率，其具有灵敏性高、特异性强的特点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例4的标准质粒按10倍梯度稀释后检测得到的标准曲线；图2为本专利技术实施例4的标准质粒按2倍梯度稀释后检测得到的标准曲线；图3为本专利技术实施例5的特异性检测试验结果；图4为本专利技术实施例7的实验组和对照组在FAM通道中的荧光信号检测结果；图5为本专利技术实施例7的实验组和对照组在HEX通道中的荧光信号检测结果。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术的一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合及其应用、试剂盒以及方法进行具体说明。微滴数字PCR(DropletdigitalPCR，ddPCR)是近年来发展起来的快速、准确、可实现DNA绝对定量的PCR方法。其原理是通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布在一定数目的微滴中，使大部分微滴中的DNA分子数目为1或0，然后通过PCR扩增和荧光信号的累计读取阳性微滴数目，再根据泊松分布计算出(现有的数字PCR仪器基本上都自动相应软件可自动计算出DNA分子数)样本中的DNA分子数。该方法无需内参基因无需制备标准曲线，在微量核酸样品的检测中显示出很好的检测效果。基于此，专利技术人通过对伪狂犬病病毒的gB基因的保守序列进行设计出了可用于ddPCR平台的检测伪狂犬病病毒的核酸组合，其包括：第一引物对和与第一引物对相对应的第一探针，第一引物对包括碱基序列分别如SEQIDNO.1-2所示的引物，第一探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示，第一探针的5’端的荧光报告基团为HEX或VIC，第一探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。具体地，第一引物对包括上游引物gB-F和下游引物gB-R，上游引物gB-F的碱基序列如SEQIDNO.1所示，下游引物gB-R的碱基序列如SEQIDNO.2所示。通过上述核酸组合，通过gB基因的检测，实现对伪狂犬病病毒的检测，其具有较高的灵敏性和特异性，能够从低伪狂犬病病毒含量样品中检出伪狂犬病病毒，有效地避免传统检测方法出现的漏检现象。此外，根据大多数商业化伪狂犬病病毒的基因缺失疫苗都具有gE基因缺失，某些多基因缺失疫苗也是在gE基因缺失的基础上再缺失TK或gI基因等情况。本专利技术人还针对伪狂犬病病毒的gE基因设计出了相应引物和探针。以期在对病原实现准确快速检测的同时也能对所检出的伪狂犬病病毒是野毒株，还是gE缺失的疫苗毒株进行有效区分，使检测结果更可靠准确。优选地，本专利技术提供的检测伪狂犬病病毒的核酸组合还可包括：第二引物对和与第二引物对相对应的第二探针。第二引物对包括碱基序列分别如SEQIDNO.4-5所示，第二探针的碱基序列如SEQIDNO.6所示。第二探针的5’端的荧光报告基团为FAM，第二探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。需要说明的是，在这种情况下，第一探针的荧光报告基因的类别均可根据实际情况选择，只要保证其第一探针和第二探针的荧光报告基因的类别不同即可。第一探针和第二探针二者的淬灭基团则可相同，也可以不相同。其中，第二引物对包括上游引物gE-F和下游引物gE-R。上游引物gE-F的碱基序列如SEQIDNO.4所示，下游引物gE-R的碱基序列如如SEQIDNO.5所示。第二引物对和第二探针对gE基因检测，其与第一引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合，其特征在于，其包括第一引物对和与所述第一引物对相对应的第一探针，所述第一引物对包括碱基序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，所述第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述第一探针的5’端的荧光报告基团为HEX或VIC，所述第一探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。

【技术特征摘要】
1.一种检测伪狂犬病病毒的核酸组合，其特征在于，其包括第一引物对和与所述第一引物对相对应的第一探针，所述第一引物对包括碱基序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物，所述第一探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示，所述第一探针的5’端的荧光报告基团为HEX或VIC，所述第一探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。2.根据权利要求1所述的检测伪狂犬病病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合还包括：第二引物对和与所述第二引物对相对应的第二探针，所述第二引物对包括碱基序列分别如SEQIDNO.4-5所示的引物，所述第二探针的碱基序列如SEQIDNO.6所示，所述第二探针的5’端的荧光报告基团为FAM，所述第二探针的3’端的淬灭基团为BHQ或TAMRA。3.权利要求1或2所述的检测伪狂犬病病毒的核酸组合在检测伪狂犬病病毒中的应用。4.一种检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的检测伪狂犬病病毒的核酸组合。5.根据权利要求4所述的检测伪狂犬病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTP、TaqDNA聚合酶中的一种或多种。6.一种检测伪狂犬病病毒的方法，其特征在于，其包括：往PCR体系中加入第一引物对和与所述第一引物对相对应的第一探针，所述PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：林华，陈世界，肖艳，杨苗，任梅渗，安微，孙颖杰，严玉宝，胡娟，薛昌华，
申请(专利权)人：四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心，成都大学，
类型：发明
国别省市：四川,51