一种同时检测人冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的实时荧光多重RT-PCR方法技术

本发明专利技术提供了一种实时荧光多重RT-PCR的引物和相关试剂盒以及利用该引物同时检测冠状病毒229E、OC43、NL63和HKU1的方法。利用所述引物的实时荧光多量PCR检测方法能够通过扩增产物的溶解温度同时检测四种冠状病毒，操作简单，方便快捷。本发明专利技术方法特异性好，灵敏度高，适用于临床和实验室检测。

Real time fluorescent multiplex RT-PCR method for simultaneous detection of human coronavirus 229E, OC43, NL63 and HKU1

The present invention provides one kind of real time fluorescent multiplex RT-PCR primer and related reagent kit and method for simultaneously detecting coronavirus 229E, OC43, NL63 and HKU1 by using the same. By using the real-time fluorescence quantitative PCR detection method of the primer, four kinds of coronavirus can be detected simultaneously through the dissolution temperature of the amplification product, and the operation is simple, convenient and quick. The method has the advantages of good specificity and high sensitivity, and is suitable for clinical and laboratory testing.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒的生物检测
，具体涉及一种同时检测人冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的实时荧光多重RT-PCR中使用的引物及相关试剂盒。
技术介绍
人冠状病毒(Humancoronavirus，HCoV)是具外套膜的单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科。因在电子显微镜下可见如日冕般外围的冠状，因此被称为冠状病毒。目前，已被发现的人冠状病毒的种类有6种。其中四种人冠状病毒(229E，OC43，NL63和HKU1)是目前在人群中常发的，并且与大多数的人呼吸系统疾病相关，例如常见的感冒及具有高发病率的肺炎和支气管炎。冠状病毒的感染分布在全世界多个地区，病毒通过呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷嚏、接触传染，并通过空气飞沫传播，感染高峰集中在秋冬和早春。目前，国内外检测冠状病毒方法主要有以下几种：(1)病毒的分离培养，这也是检测病毒感染的“金标准”。但是其只能检测样本中具有感染能力的病毒颗粒，因而灵敏度不足，并且操作烦琐，耗费时间长，因此并不能用于现场检测。(2)免疫学方法检测病毒的特异性抗体。该方法的不足之处在于具有滞后性，因此并不利于疾病的早期诊断。(3)病毒的核酸分子检测。这类方法克服了上述两种方法灵敏度低的缺点，具体包括反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)和多重实时荧光定量PCR(MultiplexqPCR)，前者无法对病毒的核酸进行定量，后两者通过在PCR反应体系中加入荧光染料或者荧光基团标记的特异性探针不仅实现了对整个PCR进程的实时监测，还可以对模板进行定性和定量，无需电泳，方便的同时也减少污染的发生。目前，还没有操作简单、灵敏度高、实时定量、并且能够同时检测多种冠状病毒的试剂盒上市。冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1已成为人群呼吸道感染的主要病原体，所引起的呼吸道疾病严重威胁到人类的健康。因此，本领域迫切需要开发同时检测人冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的实时荧光多重RT-PCR的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种同时检测人冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的实时荧光多重RT-PCR的试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供了一种检测冠状病毒的引物组合(或引物集)，所述引物组合包括4对引物，分别特异性结合于以下基因并用于扩增对应于所述各基因的特异性扩增产物：冠状病毒229E的M基因、冠状病毒OC43的N基因、冠状病毒NL63的N基因和冠状病毒HKU1的N基因。在另一优选例中，所述冠状病毒包括人冠状病毒。在另一优选例中，所述各基因的特异性扩增产物的长度L1、L2、L3和L4均为150-700bp，较佳地160-600bp，更佳地180-550bp。在另一优选例中，所述冠状病毒229E、OC43、NL63和HKU1的扩增产物的溶解温度(T1、T2、T3、T4)各不相同，且相互之间相差至少0.2℃，较佳地至少0.5℃。在另一优选例中，所述冠状病毒229E、OC43、NL63和HKU1的扩增产物的溶解温度(T1、T2、T3、T4)相互之间相差(差值)≥1℃。在另一优选例中，所述冠状病毒HKU1的扩增产物的溶解温度为77-79℃，所述冠状病毒NL63的扩增产物的溶解温度为79-82℃，所述冠状病毒229E的扩增产物的溶解温度为82-84℃，并且所述冠状病毒OC43的扩增产物的溶解温度为84-86℃。在另一优选例中，所述的各基因的特异性扩增产物的长度L1、L2、L3和L4各不相同，且相互之间相差至少5bp。在另一优选例中，所述冠状病毒229E的M基因的扩增产物长度为480-550bp，OC43的N基因，NL63的N基因和HKU1的N基因的的扩增产物长度为150-300bp。在另一优选例中，所述冠状病毒229E的M基因的扩增产物长度为500-520bp，OC43的N基因，NL63的N基因和HKU1的N基因的的扩增产物长度为180-270bp。在另一优选例中，所述引物组合把包括选自下组的第一和第二引物对：第一引物对：229E-F引物：序列如SEQIDNO:1所示；229E-R引物：序列如SEQIDNO:2所示；第二引物对：OC43-F引物：序列如SEQIDNO:3所示；OC43-R引物：序列如SEQIDNO:4所示。在另一优选例中，所述引物组合把包括选自下组的第一、二、三和四引物对：第一引物对：229E-F引物：序列如SEQIDNO:1所示；229E-R引物：序列如SEQIDNO:2所示；第二引物对：OC43-F引物：序列如SEQIDNO:3所示；OC43-R引物：序列如SEQIDNO:4所示；或OC43-F引物：序列如SEQIDNO:9所示；OC43-R引物：序列如SEQIDNO:10所示；第三引物对：NL63-F引物：序列如SEQIDNO:5所示；NL63-R引物：序列如SEQIDNO:6所示；第四引物对：HKU1-F引物：序列如SEQIDNO:7所示；和HKU1-R引物：序列如SEQIDNO:8所示。在本专利技术的第二方面，提供了一种PCR扩增体系，所述的体系包括：用于扩增的缓冲体系以及位于所述体系中的本专利技术的第一方面所述的引物组合。在本专利技术的第三方面，提供了一种同时检测人冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的试剂盒，所述试剂盒中包括(i)容器，和(ii)位于所述容器中的如本专利技术的第一方面所述的引物组合。在另一优选例中，所述的试剂盒包括：第一容器，以及位于所述第一容器中的第一引物对；第二容器，以及位于所述第二容器中的第二引物对；第三容器，以及位于所述第三容器中的第三引物对；第四容器，以及位于所述第四容器中的第四引物对，其中，所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器可以是各自独立的或为同一容器(包括二个、三个或四个容器为同一容器)。在另一优选例中，第一容器、第二容器、第三容器和第四容器是同一容器；并且所述的第一、二、三和四引物对被混合在一起。在另一优选例中，所述的试剂盒还含有(c)用于扩增的试剂，包括缓冲剂、dNTP等；和(d)用于检测的试剂，如荧光染料。在另一优选例中，所述试剂盒还包括使用说明书。在本专利技术的第四方面，提供了一种实时荧光多重RT-PCR方法，包括步骤：(a)利用如本专利技术的第一方面所述的引物组合，对检测样品进行实时荧光多重RT-PCR。在另一优选例中，所述的方法是非诊断性的方法。在另一优选例中，所述的方法是体外方法。在本专利技术的第五方面，提供了一种同时检测冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的方法，包括步骤：(a)利用本专利技术的第一方面所述的引物组合，对检测样品进行实时荧光多重RT-PCR；和；(b)分析扩增产物的溶解曲线，从而判定所述检测样品中冠状病毒229E，OC43，NL63和HKU1的存在与否和/或数量。在另一优选例中，所述步骤(a)中，在所述荧光多重RT-PCR中，是在含有核酸染料的反应体系中进行。在另一优选例中，所述核酸染料包括SYTO9。在另一优选例中，所述步骤(b)包括分析不同扩增产物的溶解峰图和/或溶解温度。在另一优选例中，所述的方法是非诊断性的方法。在另一优选例中，所述的方法是体外方法。应理解，在本专利技术范围内，本专利技术的上述各技术特征和在下文(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测冠状病毒的引物组合(或引物集)，其特征在于，所述引物组合包括4对引物，分别特异性结合于以下基因并用于扩增对应于所述各基因的特异性扩增产物：冠状病毒229E的M基因、冠状病毒OC43的N基因、冠状病毒NL63的N基因和冠状病毒HKU1的N基因。

【技术特征摘要】
1.一种检测冠状病毒的引物组合(或引物集)，其特征在于，所述引物组合包括4对引物，分别特异性结合于以下基因并用于扩增对应于所述各基因的特异性扩增产物：冠状病毒229E的M基因、冠状病毒OC43的N基因、冠状病毒NL63的N基因和冠状病毒HKU1的N基因。2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述冠状病毒229E、OC43、NL63和HKU1的扩增产物的溶解温度(T1、T2、T3、T4)相互之间相差(差值)≥1℃。3.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述冠状病毒HKU1的扩增产物的溶解温度为77-79℃，所述冠状病毒NL63的扩增产物的溶解温度为79-82℃，所述冠状病毒229E的扩增产物的溶解温度为82-84℃，并且所述冠状病毒OC43的扩增产物的溶解温度为84-86℃。4.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述冠状病毒229E的M基因的扩增产物长度为480-550bp，OC43的N基因，NL63的N基因和HKU1的N基因的的扩增产物长度为150-300bp。5.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合把包括选自下组的第一和第二引物对：第一引物对：229E-F引物：序列如SEQIDNO:1所示；229E-R引物：序列如SEQIDNO:2所示；第二引物对：OC43-F引物：序列如SEQIDNO:3所示；OC43-R引物：序列如SEQIDNO:4所示。6.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合把包括选自下组的第...

【专利技术属性】
技术研发人员：张弛宇，张亚楠，蓝柯，
申请(专利权)人：中国科学院上海巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31