用于动脉粥样硬化不稳定斑块识别的超声荧光双模态纳米探针的制备方法技术

本发明专利技术涉及超声分子探针领域，尤其涉及一种用于动脉粥样硬化不稳定斑块识别的超声荧光双模态分子探针及其制备方法和应用。一种超声荧光分子探针，包括抗体以及连接于所述抗体巯基上的超声造影基团和抗体游离氨基上的荧光基团，所述超声造影基团通过碳硫键和所述抗体巯基共价连接，荧光基团通过酰胺键与所述抗体共价连接。本发明专利技术丰富动脉粥样硬化斑块的诊断方法，通过超声和荧光双模态成像技术，识别易损斑块，从而早期预防心血管事件。

Method for preparing ultrasonic fluorescent double mode nano probe for identifying unstable atherosclerotic plaque

The invention relates to the field of ultrasonic molecular probes, in particular to an ultrasonic fluorescent double mode molecular probe for identifying atherosclerotic unstable plaques and a preparation method and application thereof. An ultrasonic fluorescence probe, including fluorescent group ultrasound contrast group and antibody free amino antibody and connected to the thiol antibody on the contrast group, connected by carbon sulfur bond and the covalent thiol antibody, fluorescent antibody covalently connected with the through amide bond. The invention provides a method for diagnosing atherosclerotic plaques, which is used to identify vulnerable plaques by means of ultrasound and fluorescence imaging technology, thereby preventing early cardiovascular events.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及超声分子探针领域，尤其涉及一种用于动脉粥样硬化不稳定斑块识别的超声荧光双模态分子探针及其制备方法和应用。
技术介绍
缺血性心脏病已逐渐成为威胁人类健康的第一杀手，包括心肌梗死在内的急性冠脉事件是冠心病致死及降低公众生活质量的首要原因。而在急性冠脉事件中，易损斑块的破裂是导致急性心血管事件的主要元凶。易损斑块由薄的纤维帽、包含脂质和活化巨噬细胞的较大坏死物核心及微钙化构成，它们均为急性心血管事件最强的预测因素之一，斑块的不稳定性极易触发血栓形成进而血管闭塞和心肌梗死。动脉粥样硬化斑块进展过程中，骨桥蛋白OPN在巨噬细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞均有表达，且具有募集巨噬细胞的作用，引起坏死中心扩大，纤维帽的变薄，直到在血液的剪切力下斑块发生破裂。同时OPN基因是血管平滑肌由收缩表型向合成表型转化的标志性基因，斑块不稳定性成分微钙化中OPN也扮演着举足轻重的角色。超声微泡造影剂是一类能显著增强超声背向散射强度的化学制剂，微泡在超声作用下发生震动，散射强超声信号，得到超声回波，从而清晰显示组织位置结构大小。由于其安全无毒无污染，可无创显影，可重复可定量，支持实时动态观察，包壳及核心均可修饰，可设计多靶点和多模式的分子探针，可包裹药物实现诊疗一体化，灵敏度高等优点，近年来在更加精细化的超声诊断及治疗中呈现出良好的应用前景。荧光染料由于其灵敏度高、操作方便、低成本、无辐射等优点逐渐取代了放射性同位素作为检测标记，广泛应用于分子影像领域。靶向分子探针通常由识别基团和报告基团组成，前者决定探针的选择性和特异性，后者决定识别的灵敏度。
技术实现思路
本专利技术结合当今冠心病临床介入诊疗中血管腔内超声成像的广泛应用，利用上述背景中技术，提供用于动脉粥样硬化不稳定斑块超声荧光分子影像学成像探针及其制备方法，其将丰富动脉粥样硬化斑块的诊断方法，通过超声和荧光双模态成像技术，识别易损斑块，从而早期预防心血管事件。一种超声荧光分子探针，包括抗体以及连接于所述抗体巯基上的超声造影基团和抗体游离氨基上的荧光基团，所述超声造影基团通过碳硫键和所述抗体巯基共价连接，荧光基团通过酰胺键与所述抗体共价连接。优选的，所述抗体上的巯基与超声造影基团上的马来酰亚胺基共价连接；所述抗体的游离α氨基与荧光基团形成酰胺键共价连接。优选的，所述抗体上的二硫键通过还原剂打开形成巯基，所述巯基与所述马来酰亚胺基形成碳硫键共价连接；所述赖氨酸的α氨基与荧光基团形成酰胺键共价连接。优选的，所述马来酰亚胺基连接于聚乙二醇一端，聚乙二醇的聚合物分子量优选为2000Da。优选的，所述超声造影基团带有负电荷。优选为以带负电荷的有机高分子材料为组分，更优选为新型可生物降解材料聚乳酸。优选的，所述荧光染料为菁染料Cy5.5-N-羟基琥珀酰亚胺酯或吲哚菁绿ICG。一种制备超声荧光分子探针的方法，包括：将抗体和荧光染料与超声造影基团连接形成所述荧光分子探针，具体包括：在催化剂的存在下，分别使带有羧基的荧光染料与抗体的α氨基接触，形成酰胺键共价连接；在还原剂存在下，打开抗体的二硫键，使带有马来酰亚胺基的超声造影基团与抗体的巯基接触，形成碳硫键共价连接，得到所述荧光分子探针。优选的，所述催化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐。具体包括以下步骤：(1)取100mg聚乳酸(PLA,MW80000)置于烧瓶中，加入3.5ml二氯甲烷、100ul全氟溴辛烷充分混匀制得油相；(2)取20ml聚乙烯醇水溶液于烧杯中，将油相逐滴加入，置1.27cm钛合金探头下以80％输出振幅冰浴超声2min得到乳剂；(3)将所得乳剂上覆有孔锡箔，置于磁力搅拌器上室温搅拌3～4h，使二氯甲烷充分挥发，所得液体装入10ml离心管中15℃5000g离心5min，取沉淀部分于15℃10000g5min去离子水清洗离心三次并充分分散重悬为1ml液体，马尔文粒度仪检测颗粒粒径及Zeta电位，取100ul液体冻干过夜称重定量并计算总量，冻干粉不可参与下步反应，弃之；(4)以与聚乳酸摩尔比为1:500的比例计算所需EDC及NHS质量并称重，各取500ulMES缓冲液(pH5.5)溶解,将所得EDC溶液、NHS溶液、上步所得PLA微泡悬液加入烧瓶中，用MES缓冲液定量至5ml反应体系，室温反应1小时活化微泡表面羧基，后用1×PBS缓冲液10000g5min离心重悬清洗3次；(5)以与聚乳酸摩尔比为1:3的比例计算所需NH2-PEG-mal(MW2000)的质量并称重，取500ul1×PBS溶解，将所得NH2-PEG-mal溶液、上步所得PLA微泡悬液置于烧瓶中，用1×PBS缓冲液定量至5ml反应体系，室温搅拌过夜后置于4℃冰箱备用；(6)取50ulCy5.5标记的抗体(1mg/ml)加入450ul10×PBS缓冲液，得到总液量加入等体积的TCEP(10×PBS溶解50mmol/L)室温反应30min打开抗体二硫键，得到游离巯基；(7)将(6)步骤所得具有游离巯基的抗体用50k超滤管6000r/min10min/次Tris缓冲液超滤2次除去TCEP；(5)步骤所得PLA-PEG-mal加入Tris缓冲液10000g15℃5min/次离心重悬2次，与抗体置于西林瓶中锡纸包裹避光搅拌过夜，所得产物1×PBS离心重悬得到Cy5.5-anti-OPN-PEG-PLA-PFOB；其中荧光染料Cy5.5与抗体的连接方法如下：1)将抗体原液(1mg/ml)50ul加入0.5ml100k超滤管中，1×PBS补足500ul，6000g离心10分钟除去抗体储存液中的BSA，荧光染料Cy5.5，SE用DMSO溶解至浓度为1mg/ml；2)优选Cy5.5与抗体摩尔投料比为20:1，所得F/P＝4.6:1；用50k超滤管将步骤1所得抗体超滤入碱性PB缓冲液(pH＝8.5)中，PB缓冲液补至900ul，加入14ulCy5.5，SE(DMSO)，DMSO总量补至100ul，锡纸避光室温搅拌过夜；3)步骤2)所得反应体系用1×PBS缓冲液50k超滤管超滤离心(6000r/min10min)清洗，直至超滤所得废液完全无色透明。本专利技术提供了一种用于动脉粥样硬化不稳定斑块超声荧光分子影像学成像探针，该探针由OPN抗体和聚乙二醇(PEG)修饰的聚乳酸(PLA)微泡缩合而成，OPN抗体的巯基与纳米颗粒表面PEG的马来酸亚胺基通过碳硫键稳定连接。其中，聚乙二醇(PEG)修饰的PLA微泡直径在250nm左右，大小均一，Zeta电位为-20mv。该用于动脉粥样硬化不稳定斑块超声荧光分子影像学成像探针探针的制备方法为：将100mgPLA和100ul全氟溴辛烷(PFOB)分散于3.5ml二氯甲烷制得油相，滴入20ml聚乙烯醇水溶液中，置1.27cm钛合金探头下冰浴超声2min得到乳剂；加入与聚乳酸摩尔比为1:500的EDC、NHS，37℃下反应1小时，加入与聚乳酸摩尔比为1:3的NH2-PEG-MAL，常温搅拌过夜；OPN抗体经TECP打开二硫键后与聚乳酸微泡表面PEG的马来酰亚胺基通过碳硫键稳定连接，经离心分离得到OPN靶向的超声探针Cy5.5-anti-OPN-PEG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超声荧光分子探针，包括抗体以及连接于所述抗体巯基上的超声造影基团和抗体游离氨基上的发光基团，所述超声造影基团通过碳硫键和所述抗体巯基共价连接，发光基团通过酰胺键与所述抗体共价连接。

【技术特征摘要】
1.一种超声荧光分子探针，包括抗体以及连接于所述抗体巯基上的超声造影基团和抗体游离氨基上的发光基团，所述超声造影基团通过碳硫键和所述抗体巯基共价连接，发光基团通过酰胺键与所述抗体共价连接。2.根据权利要求1所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述抗体上的巯基与超声造影基团上的马来酰亚胺基共价连接；所述抗体的游离α氨基与所述发光基团形成酰胺键共价连接。3.根据权利要求2所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述马来酰亚胺基连接于聚乙二醇一端。4.根据权利要求1-3任一项所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述超声造影基团带有负电荷。5.根据权利要求1-3任一项所述的超声荧光分子探针，其特征在于，所述发光基团为菁染料。6.一种制备权利要求1-5任一项所述的超声荧光分子探针的方法，包括：将抗体和发光基团与超声造影基团连接形成所述荧光分子探针，所述方法包括：在催化剂的存在下，分别使带有羧基的发光基团与抗体的α氨基接触，形成酰胺键共价连接；在还原剂存在下，打开抗体的二硫键，使带有马来酰亚胺基的超声造影基团与抗体的巯基接触，形成碳硫键共价连接，得到所述荧光分子探针。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述催化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)取100mg聚乳酸(PLA,MW80000)置于烧瓶中，加入3.5ml二氯甲烷、100ul全氟溴辛烷充分混匀制得油相；(2)取20ml聚乙烯醇水溶液于烧杯中，将油相逐滴加入，置1.27cm钛合金探头下以80％输出振幅冰浴超声2min得到乳剂；(3)将所得乳剂上覆有孔锡箔，置于磁力搅拌器上室温搅拌3～4h，使二氯甲烷充分挥发，所得液体装入10ml离心管中15℃5000g离心5min，取沉淀部分于15℃10000g5min去离子水清洗离心三次并充分分散重悬为1ml液体，马尔文粒度仪检测颗粒粒径及Zeta电位，取100ul液体冻干过夜称重定量并计算总量，冻干粉不可参与下步反应，弃之；(4)以与聚乳酸摩尔比为1:500的比例计算所需EDC及NHS质量并称重，各取...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹丰，苟田田，戴志飞，王亚斌，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，曹丰，
类型：发明
国别省市：北京;11