用于进行CVD风险评估的生物化学标志物制造技术

本发明专利技术涉及用于进行CVD风险评估的生物化学标志物，以及用于对包含新表位的肽片段进行定量的生物测定方法，所述新表位通过以蛋白酶切割动脉粥样硬化斑块的蛋白质例如光亮蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、III型胶原蛋白、CRP、ApoE或弹性蛋白而形成，所述方法包括将样品例如尿或血清与对所述新表位具有反应性的抗体相接触，以及测定所述免疫结合配偶体与所述样品中肽片段的结合水平。所述测定可预测心血管疾病事件的风险。

Biochemical markers for CVD risk assessment

The present invention relates to a biochemical marker for CVD risk assessment, and the method for determining the quantitation of peptide fragments contains new epitopes of the organisms, the new epitopes by protease cleavage of atherosclerotic plaque proteins such as light proteoglycan, multifunctional proteoglycan, basement membrane proteoglycans, decorin, biglycan, collagen type III, CRP, ApoE or elastin formation, the method includes samples such as urine or serum antibody response to the new epitopes in contact, and the determination of the immune binding level of peptide fragments and partners in the sample. The measurement may predict the risk of cardiovascular events.

【技术实现步骤摘要】
本申请是中国专利申请CN200880123912.0的分案申请，原申请是国际申请号PCT/EP2008/064946于2010年7月2日进入中国国家阶段的申请。
本专利技术涉及检测对心血管疾病诊断目的和疾病发展预后有价值的生物化学标志物的测定，其包括指示由发生动脉粥样硬化和斑块不稳定性所导致的心血管事件风险的生物化学标志物。
技术介绍
心血管疾病(cardiovasculardisease，CVD)是世界范围内致病及死亡的首要原因。目前，尚没有允许诊断并将患者归类为不同风险组以及允许诊断低风险患者的有效且非介入性的诊断方法。诊断和预后工具主要由简单标志物的多变量分析构成，例如年龄、吸烟情况和多种脂质和脂蛋白的浓度。CVD涵盖数种临床综合征，主要有心绞痛、心肌梗死(冠状动脉栓塞)和中风。所有这些综合征通常都是复杂动脉粥样硬化的后遗症。动脉粥样硬化开始于童年阶段的内膜增厚，并发展成为动脉内膜中的脂肪条纹，这些病变分别表征为I型和II型。脂肪条纹是动脉粥样硬化发展过程中最早的宏观可见病变，其在所有种族和社会的几乎所有人类中发生。在非致病状态下，内皮细胞(endothelialcell，EC)对白细胞的粘附性相互作用有抗性。但是，动脉粥样化形成过程中动脉壁中促炎症细胞因子以及积累的氧化脂蛋白的作用引发粘附分子的表达，例如主动脉EC表面上的细胞间粘附分子(intercellularadhesionmolecule，ICAM)-1和血管细胞粘附分子(vascularcelladhesionmolecule，VCAM)-1。这使得白细胞能被内皮表面捕获并移行进血管壁的内膜部分。斑块的发生包括发生移位和凋亡的平滑肌细胞(smoothmusclecell，SMC)个数的增加，其导致基质周转(turnover)增加。受损的胶原蛋白合成可导致纤维帽削弱并产生更易于破裂的动脉粥样硬化斑块；但是，大多数研究者认为，蛋白水解酶例如基质金属蛋白酶(matrixmetallo-protease，MMP)及其它蛋白酶的作用对斑块破裂的风险有重要的贡献(Clarkson和Kaplan509-28)。斑块可分为两种不同类型：“脆弱的”和“稳定的”斑块。但是，对于详细的组织学分析和对分子的认识，经常使用更详细的分类。斑块的发生有三个主要阶段：起始、脂肪条纹和复杂/晚期斑块(StaryH.C.)。动脉粥样硬化斑块在动脉内膜内发生，并可根据其组成和结构进行分类。这种分类将病变分为8个类型(StaryH.C.)：I.内膜中载有脂滴并被其增大的巨噬细胞(巨噬细胞源性泡沫细胞)增多。II.巨噬细胞源性泡沫细胞与内膜SMC内的脂滴一起在蛋白聚糖层深部积累。泡沫细胞层以脂肪条纹的形式可见。在II型病变中，单核细胞通过单核细胞趋化蛋白(主要是MCP-1)穿透内皮细胞层，所述趋化蛋白在人粥样斑中过表达。早期病变类型(I型和II型)可以在婴儿期开始，但不一定导致斑块破裂。此外，动脉粥样硬化的发展可以在形成III型病变之后结束，斑块的形成是无法预测的(StaryH.C.)。III.III型病变确定为处于脂肪条纹(II型)和粥样斑(IV型)之间的中间病变。这些病变还含有胞外脂质的混合物，由此使得内膜深部肌肉弹性层中通常紧密相邻的SMC之间的间距扩大。物质混合物可取代通常位于这里的蛋白聚糖和胶原纤维，但是这在动脉粥样化形成的这一阶段造成的影响很小。IV.粥样斑是动脉粥样硬化的第一个临床体征。细胞外脂质混合物的积累所导致的动脉内膜中SMC的移位以及内膜结构的破坏是IV型病变的标志。脂质核心的形成是这种SMC移位的最终结果。脂质核心的形成导致壁增厚加剧。脂质核心是内膜深处大且界限明确的区域，在此处动脉壁这一部分的正常结构成分已经被致密堆积的泡沫细胞残留物、游离脂滴、胆固醇晶体和钙颗粒所取代。在动脉粥样硬化发展的这一阶段，在正常情况下位于该区域中的SMC减少或者完全失去。任何残留的SMC开始广泛分散，产生长形细胞体，并且常常具有异常厚的基底膜。在此阶段，开始形成覆盖在脂质核心上的层。该层由富含胶原蛋白和蛋白聚糖的细胞间基质、含和不含脂滴的SMC、巨噬细胞和泡沫细胞组成。V.对IV型病变的应答是形成修复性纤维组织基质，形成纤维“帽”。通常，这些病变会由彼此不规则堆叠的脂质核心和修复性组织的层组成。另外，诸如血肿和血栓形成等事件可额外并发这些病变类型。如果不致命，则这些病变并发症整合到病变中，其上长出修复性基质组织的薄层，其由胶原蛋白和蛋白聚糖组成。在形成所述帽的过程中，动脉粥样硬化斑块中细胞外基质蛋白胶原和蛋白聚糖的含量增加。VI.内皮的缺损例如裂隙、磨蚀、溃疡、血肿、血栓、出血在并发情况下可导致更复杂的病变类型，称为VI型病变。VII.该病变经常称为钙化病变，其中病变中超过50％由矿物质组成。除了钙化之外，这些病变还含有丰富的修复性纤维结缔组织。当滞留于此的SMC发生凋亡和崩解时，它们的矿化细胞器变成钙化的一部分。VIII.钙化病变之后是纤维化病变。纤维化病变可完全由胶原蛋白组成，不含脂质。(StaryH.C.)心血管事件经常是斑块破裂的结果，其中炎症与蛋白酶的释放减弱了纤维帽的肩部区域，使得斑块中的脂肪物质与血液相接触，沉淀形成附壁血栓(Clarkson和Kaplan)。蛋白酶活性增加连同基质产生的减少导致纤维帽变薄，这被认为是斑块不稳定的标志，其增加了破裂的风险。斑块的脆弱性及其破裂的风险是临床上关注的领域。脆弱斑块(vulnerableplaque，VP)的没有标准定义，但是一般认可与稳定斑块相比存在三种组织学标志：1)更大的脂质核心(＞全部病变的40％)。2)更薄的纤维帽(65-150微米)。3、)大量急性炎性细胞。定义VP的主要标准包括：活跃的炎症(存在单核细胞、巨噬细胞和T细胞)、具有大脂质核心的薄帽、伴随表面血小板凝集的内皮剥蚀、有裂隙的斑块以及＞90％的动脉狭窄。其它次要标准包括：表面钙化结节、斑块内出血、内皮功能障碍以及向外的重塑(Shin，Edelberg和Hong)。斑块复杂性、不稳定性和破裂可以通过医学治疗和/或生活方式的改变来抑制。但是，在一些情况下，可能需要更为介入性的方法，即血管成形术或旁路手术。目前，诊断工具是基于仍处于开发之中的静态图象分析，或者基于低技术的方法例如与CVD风险相关的心脏收缩压和舒张压水平。该领域一直致力于开发可更好地鉴别高风险患者的多变量分析。一个这样的模型是SCORE模型(系统性冠状动脉风险评本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于对包含新表位的肽片段进行定量的生物测定方法，所述新表位是由蛋白酶对动脉粥样硬化斑块的蛋白质进行切割而形成的，所述方法包括将包含所述肽片段的样品与对所述新表位具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶体相接触，以及测定所述免疫结合配偶体与所述样品中肽片段的结合水平。

【技术特征摘要】
2007.11.05 GB 0721713.6;2007.11.20 GB 0722748.1;201.用于对包含新表位的肽片段进行定量的生物测定方法，所述新表位是由蛋白酶对动
脉粥样硬化斑块的蛋白质进行切割而形成的，所述方法包括将包含所述肽片段的样品与对
所述新表位具有特异性结合亲和力的免疫结合配偶体相接触，以及测定所述免疫结合配偶
体与所述样品中肽片段的结合水平。
2.根据权利要求1的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含C端新表位的肽片段具有特
异性结合亲和力。
3.根据权利要求1的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含N端新表位的肽片段具有特
异性结合亲和力。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含新表位的肽片段
具有特异性结合亲和力，所述新表位是由蛋白酶在CRP的下列任一部分序列中对CRP进行切
割而形成的：
K＊ESDTSYVSLKAPLT＊K
G＊GNFEGSQSLVGDIG＊NA＊LKYEVQGEVFTKPQ＊L
G＊IVEFWVDGKPRV＊R
R＊KAFVFPKE＊S
K＊YEVQGEVFTKPQLWP＊-
D＊SFGGNFEGSQS＊L
D＊FVLSPDEINT＊I
S＊LKKGYTVGAEA＊S
A＊FGQTDMSRKA＊F
S＊LKKGYTVGAEAS＊I
G＊EVFTKPQLWP＊-
S＊IILGQEQDSFGGN＊F
K＊YEVQGEVFTKPQ＊L。
5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含新表位的肽片
段具有特异性结合亲和力，所述新表位是由蛋白酶在ApoE的下列任一部分序列中对ApoE进
行切割而形成的：
A＊KVEQAVETEPEPELR＊Q
A＊KVEQAVETEPEPELR＊Q
V＊AEVRAKLEEQAQQI＊R
A＊KVEQAVETEPEPELR＊Q
A＊MLGQSTEELRV＊R(M-氧化)
E＊QAVETEPEPELR＊Q
R＊QQTEWQSGQRWE＊L
L＊AVYQAGAREGAERGLS＊A
R＊AKLEEQAQQIR＊L




1-->


\tA＊KLEEQAQQIRLQ＊A
A＊KVEQAVETEPEPELR＊Q
K＊VEQAVETEPEPELR＊Q
E＊QAVETEPEPELR＊QD＊EVKEQVAEVRAKLE＊E。
6.根据权利要求4或5的方法，其中所述免疫结合配偶体对肽N端的下列任一序列具有
特异性结合亲和力：
或者对肽C端的下列任一序列具有特异性结合亲和力：
7.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述肽片段是光亮蛋白聚糖、多功能蛋白聚
糖、基底膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖的片段。
8.根据权利要求7的方法，其中所述免疫结合配偶体对包含新表位的肽片段具有特异
性结合亲和力，所述新表位是由蛋白酶在光亮蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、基底膜蛋白聚
糖、核心蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖的下列任一部分序列中切割光亮蛋白聚糖、多功能蛋
白聚糖、基底膜蛋白聚糖、核心蛋白聚糖或双糖链蛋白聚糖而形成的：
SVPKEISPDTTLLDLQNNDISE
KSVPKEISPDTTLLDLQNNDISE
NSGFEPGAFDGLKLNYLRISEAK
LKSVPKEISPDTTLLDLQNNDISE
LRISEAKLTGIPKDLPET
LKSVPKEISPDTTLLDLQNNDISE
LTGIPKDLPETLNELHLDHNKIQAIE
IVIELGTNPLK
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LATVGELQAAWRETTVLVAQNGNIK
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EAKLTGIPKDLPETLNE
LKAVPKEISPDTTLLDLQNNDISE
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DEASGIGPEVPDDR




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【专利技术属性】
技术研发人员：莫滕·卡尔斯达尔，佩尔·奎斯特，娜塔莎·巴拉斯丘克，
申请(专利权)人：北欧生物科技公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK