【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及免疫测定，特别是用于检测和/或监测患者癌症的免疫测定，以及用于实施所述免疫测定的单克隆抗体和免疫测定试剂盒。
技术介绍
1、癌症是一个主要的全球健康问题，并且全球癌症发病率和死亡率的负担正在上升[1]。该问题的一部分是缺乏除其他外还可以早期检测癌症并预测对治疗的响应的相关生物标记物工具。此外，传统的生物标记物通常涉及侵入性程序，诸如组织活检[2]。这些方法的一个有希望的替代方法是液体活检。近年来，癌细胞周围的肿瘤微环境受到了更多的关注，并且是寻找非侵入性生物标记物的最佳场所。
2、特别是，被定义为组织的非细胞部分的细胞外基质被认为是癌症发展的重要部分[3]。主要的ecm蛋白是胶原蛋白(collagen)，其对于肿瘤硬度、肿瘤免疫和癌症转移是重要的[4]。在癌症中，ecm形成和降解的动态平衡被打破了。肿瘤微环境中的细胞影响胶原蛋白的重塑，而胶原蛋白反过来影响细胞的行为[4，5]。胶原蛋白诸如iv型在癌症背景下具有被充分描述的表达模式、定位和功能。胶原蛋白在基底膜中无处不在，并作为入侵的肿瘤细胞的屏障，其可以被分解以促进转移[6，7]。然而，对胶原蛋白的大多数癌症研究集中在丰富且被良好表征的胶原蛋白上，诸如i型、iii型或iv型胶原蛋白，而许多被较少表征的胶原蛋白仍未被探索。
3、xx型胶原蛋白就是这样一种未被探索的胶原蛋白。基于其结构特征，xx型胶原蛋白是具有间断螺旋线的原纤维相关胶原蛋白(facit)家族的一部分。这种胶原蛋白家族被认为与纤维胶原蛋白相关，以调节它们的组织和相互作用[8]。x
4、人们对xx型胶原蛋白的表达、定位和功能知之甚少。xx型胶原蛋白最初克隆自鸡胚，其表达主要限于角膜上皮，但在胚胎皮肤、肺、胸骨软骨和肌腱中可检测到[8]。几位作者指出了癌症和发展之间的相似之处[9，10]。来自人类蛋白质图谱(https://www.proteinatlas.org/ensg00000101203-col20a1/tissue)的rna表达数据也表明，col20a1在人脑中的表达丰富，并且在睾丸和脾组织中相对较小地上升。来自癌症基因组图谱(tcga)提案的数据也证实了在脑中的作用，其中col20a1水平在神经胶质瘤组织中相对升高(https://www.proteinatlas.org/ensg00000101203-col20a1/pathology)。因此，通过严格观察表达水平，xx型胶原蛋白似乎在脑功能和脑癌中起作用。从这个角度来看，xx型胶原蛋白似乎并不以可评估的量存在于其他组织中。
5、尽管明显缺乏xx型胶原蛋白表达，但col20a1在癌症文献中已有描述。报告通常在dna或rna水平上且通常在广泛和一般的筛选中描述col20a1。与上述脑关联性一致，并且基于cdna微阵列，col20a1在所谓的脑肿瘤起始细胞中相比于在常规神经胶质瘤细胞系和正常脑星形胶质细胞中有所升高[12]。在一项独立的研究中，使用活检来源的神经胶质瘤细胞模型，在用组蛋白脱乙酰酶抑制剂治疗后观察到col20a1 rna的下调[13]。在其他癌症中，关于xx型胶原蛋白的报道极少，但col20a1被包括在与中国群体中乳腺癌复发、转移和低生存率相关的16个基因签名中[11]。并且据报道，col20a1在早期前列腺肿瘤发生中也上调了[14]。值得注意的是，这些筛选没有跟进关于xx型胶原蛋白的任何功能研究，因此对其功能和分布的了解仍非常缺乏。
技术实现思路
1、申请人现在已开发了一种酶联免疫吸附测定(elisa)来定量血液中xx型胶原蛋白的生物标记物(本文称为“pro-c20”)的存在。对所述测定进行了优化和验证，并将其用于测定癌症患者和健康对照的血清中的循环xx型胶原蛋白的水平。发现所述测定是稳健的，对xx型胶原蛋白具有特异性，并且对检测健康对照和患有疾病(癌症)的患者二者中的水平具有灵敏性。数据显示，与健康对照相比，癌症患者血清中的pro-c20水平显著升高。数据还显示，在患有癌症的患者中，高水平的pro-c20与较差的总生存率相关。
2、因此，在第一方面，本专利技术提供了一种免疫测定方法，所述方法包括：
3、(i)使来自患者的样品与单克隆抗体接触，所述单克隆抗体特异性结合c末端氨基酸序列qgastqglwe(seq id no:1)(这种c末端氨基酸序列在本文中称为“pro-c20”和/或“靶序列”，由所述c末端氨基酸序列组成或包含所述c末端氨基酸序列的肽在本文中也称为“pro-c20”和/或“靶肽”)；以及
4、(ii)检测并确定所述样品中所述单克隆抗体与肽之间的结合量。
5、所述方法优选地是用于检测和/或监测患者的疾病和/或评估患者的疾病的严重程度的免疫测定方法。所述方法优选地进一步包括：
6、(iii)使在步骤(ii)中确定的所述单克隆抗体的所述结合量与跟正常健康受试者相关的值产生关联、和/或与跟已知疾病严重程度相关的值产生关联、和/或与在先前时间点从所述患者获得的值产生关联、和/或与预定的截断值产生关联。
7、在优选实施方案中，所述疾病是癌症。所述癌症可以例如是膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈部癌、肾脏癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或胃癌。所述疾病尤其可以是胰腺导管腺癌(pdac)。
8、如上所述，在某些实施方案中，所述方法可以是用于评估患者疾病(例如像癌症)严重程度的方法。例如，所述方法可以是用于确定患者癌症预后的方法，例如像确定患者的可能存活时间和/或存活概率。
9、在优选实施方案中，所述单克隆抗体不特异性结合靶序列的延长形式，所述延长形式为qgastqglwes(seq id no:2)(即，pro-c20靶序列通过添加丝氨酸残基而在其c末端处延伸的形式)。优选地，所述抗体对pro-c20靶序列的亲和力与所述抗体对所述靶序列的所述延长形式的亲和力之比为至少10比1，更优选地为至少20比1或至少30比1。
10、在优选实施方案中，所述单克隆抗体不特异性结合靶序列的截短形式，所述截短形式为qgastqglw(seq id no:3)(即，pro-c20靶序列通过去除末尾的谷氨酸残基而截短的形式)。优选地，所述抗体对pro-c20靶序列的亲和力与所述抗体对所述靶序列的所述截短形式的亲和力之比为至少10比1，更优选地为至少20比1或至少30比1。
11、优选地，所述单克隆抗体是针对具有c末端氨基酸序列qgastqglwe(seq id no:1)的合成肽产生的单克隆抗体。
12、所述样品优选地是生物流体。所述生物流体可以是但不限于血液、血本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测和/或监测患者的癌症和/或评估患者的癌症的严重程度的免疫测定方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈部癌、肾脏癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或胃癌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体不特异性结合所述C末端氨基酸序列的延长形式，所述延长形式为QGASTQGLWES(SEQ ID NO:2)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体不特异性结合所述C末端氨基酸序列的截短形式，所述截短形式为QGASTQGLW(SEQ ID NO:3)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体是针对具有所述C末端氨基酸序列QGASTQGLWE(SEQ ID NO:1)的合成肽产生的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述样品是选自血液、血清或血浆的生物流体样品。
8.根据权利要求1至7中
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述免疫测定是放射免疫测定或酶联免疫吸附测定。
10.一种免疫测定试剂盒，所述免疫测定试剂盒包含特异性结合C末端氨基酸序列QGASTQGLWE(SEQ ID NO:1)的单克隆抗体，以及以下中的至少一种；
11.根据权利要求10所述的免疫测定试剂盒，其中所述单克隆抗体不特异性结合所述C末端氨基酸序列的延长形式，所述延长形式为QGASTQGLWES(SEQ ID NO:2)。
12.根据权利要求10或11所述的免疫测定试剂盒，其中所述单克隆抗体不特异性结合所述C末端氨基酸序列的截短形式，所述截短形式为QGASTQGLW(SEQ ID NO:3)。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的免疫测定试剂盒，其中所述单克隆抗体是针对具有所述C末端氨基酸序列QGASTQGLWE(SEQ ID NO:1)的合成肽产生的。
14.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合C末端氨基酸序列QGASTQGLWE(SEQID NO:1)。
15.根据权利要求14所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体不特异性结合所述C末端氨基酸序列的延长形式，所述延长形式为QGASTQGLWES(SEQ ID NO:2)。
16.根据权利要求14或15所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体不特异性结合所述C末端氨基酸序列的截短形式，所述截短形式为QGASTQGLW(SEQ ID NO:3)。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体是针对具有所述C末端氨基酸序列QGASTQGLWE(SEQ ID NO:1)的合成肽产生的。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于检测和/或监测患者的癌症和/或评估患者的癌症的严重程度的免疫测定方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈部癌、肾脏癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或胃癌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体不特异性结合所述c末端氨基酸序列的延长形式，所述延长形式为qgastqglwes(seq id no:2)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体不特异性结合所述c末端氨基酸序列的截短形式，所述截短形式为qgastqglw(seq id no:3)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体是针对具有所述c末端氨基酸序列qgastqglwe(seq id no:1)的合成肽产生的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述样品是选自血液、血清或血浆的生物流体样品。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述免疫测定是竞争性测定或夹心式测定。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述免疫测定是放射免疫测定或酶联免疫吸附测定。
10.一种免疫测定试剂盒，所述免疫测定试剂盒包含特异性结合c末端氨基酸序列qgastqglwe(s...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·索尔拉休斯尤星，N·威勒姆森，M·A·卡斯达尔，
申请(专利权)人：北欧生物科技公司，
类型：发明
国别省市：
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