血清免疫球蛋白E胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条制造技术

本发明专利技术提供了一种血清免疫球蛋白E胶体金层析定量检测试剂盒及试纸条，所述试剂盒包括：胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体。本发明专利技术采用胶体金免疫层析技术，需要与免疫层析结果判读仪联合使用。本发明专利技术所述的试剂盒以及试纸条具有操作简单，无需培训，可迅速掌握，无需大型设备，适合基层实验室或社区实验室应用。

Serum immunoglobulin E colloidal gold chromatography quantitative detection reagent kit and test strip

The invention provides a serum immunoglobulin E colloidal gold immunochromatographic quantitative detection kit and strip, the kit includes: colloidal gold labeled rat anti human IgE monoclonal antibody and Rabbit anti human IgE polyclonal antibody and Goat anti mouse IgG antibody. The invention adopts the colloidal gold immunochromatographic technique, which needs to be combined with the immunoassay instrument. The kit and the test paper strip of the invention have the advantages of simple operation, no need of training, quick control, no need of large equipment, and suitability for the application of the basic laboratory or community laboratory.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于临床医学检验领域，尤其是涉及一种血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒,采用胶体金免疫层析技术，与免疫层析结果判读仪联合使用。
技术介绍
“过敏性疾病”是指机体对某些抗原初次应答后，再次接受相同抗原刺激时发生的一种病理性免疫应答。过敏性疾病主要由免疫球蛋白E(IgE)介导，导致过敏性疾病的抗原称为“过敏原(allergen)”。过敏原进入机体后可刺激B淋巴细胞产生特异性IgE(sIgE)抗体，sIgE与肥大细胞或嗜碱性粒细胞结合使机体处于致敏状态。当相同过敏原再次进入已致敏状态机体时，过敏原与特异性IgE抗体结合而触发致敏细胞的活化，释放活性介质产生过敏反应并导致临床症状。近年来，随着社会经济的发展，生活环境的改善和生活方式的变化，过敏性疾病正在迅速增加。研究发现，正常人血清tIgE水平很低，但在发生过敏反应时会显著升高。临床上，血清tIgE测定常作为过敏反应性疾病的初筛试验或鉴别诊断指标。早期血清tIgE检测方法是上世纪60年代所建立的免疫放射分析方法。此方法以放射性核素(125I)作为标记物，采用双抗体夹心分析模式。基本原理如下：于固相材料包被抗人-IgE多克隆抗体(捕获抗体)，用125I标记抗人-IgE单克隆抗体(标记抗体)；待检血清中IgE与塑料试管表面的捕获抗体结合，同时结合标记抗体形成捕获抗体-待检IgE-标记抗体复合物，经洗涤分离游离标记抗体，通过γ计数器测定放射信号，信号强度与血清IgE含量呈正比例函数关系。免疫放射分析具有较高的分析敏感性和分析特异性，但因放射性污染问题，如今已被淘汰。目前，被临床实验室广泛使用的血清IgE定量方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、发光免疫分析(FIA)和免疫比浊分析(含散射和透射)。ELISA方法采用96-T板式方式适合批量检测，技术成熟、检测成本低；但影响酶的因素较多，分析精密度差，不适合单一标本独立检测。发光免疫分析(FIA)具有较高分析特异性和分析精密度，但国内技术尚未成熟，分析仪器及其试剂主要依靠进口，检测成本较高不适合基层医疗单位应用。免疫比浊技术(IA)需采用乳球增强比浊分析技术(PETIA)，用抗人-IgE抗体包被包被聚苯乙烯微粒作为主要试剂。当血清中IgE与聚苯乙烯微粒表面的抗IgE结合导致聚苯乙烯微粒靠近和聚集，此种聚集导致穿过溶液的光束发生散射。检测某种角度散射光，散射光的强度与样本IgE浓度呈正比例函数关系。此种方法是目前国内广泛应用血清IgE定量方法，采使用西门子(SIEMENS)公司BNProSpec特种蛋白分析仪，配套使用相应进口试剂。正常血清IgE含量很低，而过敏患者血清IgE水平较高，因此，需要较宽检测范围，为保证任何水平IgE均获得准确结构，需使用高质量抗人IgE抗体和具有监测“钩状效应”软件和硬件系统，故对分析仪器性能要求很高。如前文所述，过敏性疾病是一种常见病和多发病，且中国人口众多，地域广阔，一些基层医疗单位因不能开展血清IgE定量检测，不能对过敏性疾病进行鉴别诊断，从而加重三级甲等医院的门诊负担。同时，正常人血清IgE水平低于100IU/ml，而过敏性疾病患者含量差异很大，从每毫升几百单位到几千单位。针对异常标本，精确定量到“十”位对临床诊断，特别是鉴别诊断没有实际意义。因此，针对基层医院的“初诊”患者，急需一种简单、快速、成本低POCT产品，能够快速检测外周血IgE含量的体外诊断试剂。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种血清免疫球蛋白E胶体金层析定量检测试剂盒以及试纸条，以实现血清IgE含量的快速定量的检测。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，包括：胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体。优选的，所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体的浓度为2～20微克/毫升，优选的，5微克/毫升；所述兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体均为0.5-1.0毫克/毫升，优选0.8毫克/毫升。优选的，所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体通过如下方法制备而成，调节胶体金溶液pH至8.0-8.4；于胶体金溶液中加入抗体，搅拌5-10分钟；再加入牛血清白蛋白，至牛血清白蛋白的终浓度为2.5-25mg/mL，优选5mg/mL，搅拌混匀；再加入PEG20000，至PEG20000终浓度为1-10mg/mL，优选2mg/mL，再持续搅拌混匀；2～8℃静置过夜；离心10000～13000rpm15～45分钟，小心弃上清；得到的沉淀即为胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体。优选的，所述胶体金溶液中胶体金颗粒粒径为16-71.5nm，优选41nm的胶体金颗粒；所述抗体的加入量为0.4-0.8mg，优选0.6mg；用0.1MK2CO3或0.1MHCl调节胶体金溶液的pH。优选的，将最后制备的沉淀用含有0.5毫克/毫升PEG20000缓冲液悬浮，测定吸光度值A，调整浓度至A＝1.5(1cm/525nm)，加0.5毫克/毫升叠氮钠防腐；4℃保存，应用时将胶体金标记的鼠抗人IgE单克隆抗体稀释至5微克/毫升。本专利技术还提供了一种血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试纸条，组装试剂包括如上所述的试剂盒中的试剂；所述试剂条包括胶体金抗体垫、硝酸纤维膜、PVC垫板、加样垫以及吸水纸；其中胶体金抗体垫内置胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体；硝酸纤维膜的检测区(T区)，包被有兔抗人IgE多克隆抗体；质控区(C区)预包被有羊抗鼠IgG抗体；所述PVC垫板上依次组装有加样垫、胶体金抗体垫、硝酸纤维膜以及吸水纸；所述硝酸纤维膜的检测区靠近胶体金抗体垫，质控区靠近吸水纸。本专利技术同时提供了一种利用如上所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试纸条进行检测的方法，包括以下步骤，1)将试纸条水平放置与实验台上；待试纸条平衡至室温后，再撕开试纸条外侧的铝板袋将试纸条取出；2)新鲜血清、血浆或全血样本无需预处理，冰冻或2～8℃存储样本，应先平衡至室温再进行检测；3)取出样本稀释液，混匀备用；优选的，样本稀释液为0.01MPH7.4PBS缓冲溶液；4)加样及判读：用移液枪吸取10μL血清/血浆样本，或15μL全血样本，慢慢加到胶体金抗体垫上，立即在加样垫上加100μL样本稀释液，开始计时，10～20分钟内用免疫层析结果判读定量判定结果；超过20分钟判定，结果无效；本专利技术采用双抗体夹心模式，将待检血清滴加样本孔，样本在层析果过程中首先溶解胶体金抗体并与之形成待检IgE-鼠抗人IgE-胶体金复合物，继续泳动至T区，与捕获抗体(兔抗人IgE多克隆抗体)结合形成双抗体夹心复合物，形成紫色条带，颜色强度与待检IgE含量呈正比例函数关系。游离(过剩)的胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体泳动至C区，与羊抗鼠IgG抗体结合形成免疫复合物，显色。将测试板放入免疫层析结果判读仪内，读取胶体金颜色密度，并通过内置剂量-反应函数计算待检标本IgE含量打印实验结果。优选的，还包括校准步骤：读取试剂前确认所用免疫层析结果判读记录仪处于正常运行状态，并经过日常光度校准，仪器使用前按照标准曲线下载方式下载该批号试剂所使用标准曲线，并导入IC卡中作为试剂判读依据本文档来自技高网...

【技术保护点】
血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于，包括：胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体。

【技术特征摘要】
1.血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于，包括：胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体、兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体。2.根据权利要求1所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体的浓度为2～20微克/毫升，优选的，5微克/毫升；所述兔抗人IgE多克隆抗体、羊抗鼠IgG抗体均为0.5-1.0毫克/毫升，优选0.8毫克/毫升。3.根据权利要求1所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体通过如下方法制备而成，调节胶体金溶液pH至8.0-8.4；于胶体金溶液中加入抗体，搅拌5-10分钟；再加入牛血清白蛋白，至牛血清白蛋白的终浓度为2.5-25mg/mL，优选5mg/mL，搅拌混匀；再加入PEG20000，至PEG20000终浓度为1-10mg/mL，优选2mg/mL，再持续搅拌混匀；2～8℃静置过夜；离心10000～13000rpm15～45分钟，小心弃上清；得到的沉淀即为胶体金标记鼠抗人IgE单克隆抗体。4.根据权利要求3所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金溶液中胶体金颗粒粒径为16-71.5nm，优选41nm的胶体金颗粒；所述抗体的加入量为0.4-0.8mg，优选0.6mg；用0.1MK2CO3或0.1MHCl调节胶体金溶液的pH。5.根据权利要求3所述的血清免疫球蛋白E胶体金层析快速定量检测试剂盒，其特征在于：将最后制备的沉淀用含有0.5毫克/毫升PEG20000缓冲液悬浮，测定吸光度值A，调整浓度至A＝1.5(1cm/525nm)，加0.5毫克/毫升叠氮钠防腐；4℃保存，应用时将胶体金标记的鼠抗人IgE...

【专利技术属性】
技术研发人员：李会强，周洪锐，常艳敏，李洲，
申请(专利权)人：天津中新科炬生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12