一种检测福莫特罗胶体金免疫层析试纸条及制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种检测福莫特罗的胶体金层析试纸条及其制备方法与应用，属于免疫学技术领域和兽药残留分析技术领域。该试纸条结构包括底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫，试纸条两端设有保护膜，所述样品垫、胶体金垫、包被膜、吸水垫依次粘贴于底板上；胶体金垫上包被有胶体金标记的能识别福莫特罗的单克隆抗体；包被膜上设有偶联福莫特罗的载体蛋白溶液印制的隐形检测线，以及用羊抗小鼠IgG溶液印制的隐形质控线。本发明专利技术的胶体金层析检测试纸条具有便捷、快速、直观、时效性强等特点，适用范围广，成本低，便于推广应用。

A detection of formoterol colloidal gold immunochromatographic test strip and preparation method and Application

The invention relates to a method for detection of formoterol colloidal gold chromatography test paper and preparation method and application thereof, which belongs to the technical field of immunology and veterinary drug residue analysis technology. The strip structure comprises a bottom plate, a sample pad, a colloidal gold pad, coated membrane and absorbent pad, both ends strip is provided with a protective film, a sample pad, a colloidal gold pad, coating film, absorbent pad are pasted on the bottom plate; colloidal gold pad is coated with colloidal gold labeled monoclonal antibody to identification of formoterol; stealth detection line carrier protein solution coated film is provided with a coupling formoterol printed, and Goat anti mouse IgG solution printed contact control line. The colloidal gold chromatography test strip of the invention has the characteristics of convenience, rapid, visual and strong timeliness, and has wide application range and low cost, and is convenient for popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
一种检测福莫特罗胶体金免疫层析试纸条及制备方法与应用
本专利技术涉及一种检测福莫特罗的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法与应用，其特别适于动物组织中福莫特罗残留的检测，属于免疫学
和兽药残留分析

技术介绍
福莫特罗(Formoterol)是由日本山之内制药株式会社中央研究所开发的第三代β2-肾上腺素受体激动剂平喘药物，具有支气管扩张作用，还有抗过敏和抑制水肿的作用，可用于治疗慢性支气管哮喘、夜间哮喘、运动性哮喘、慢性阻塞性肺病以及儿童非哮喘性呼吸道疾病。近年来，随着我国对食品安全监管力度的加强，对违禁使用兽药的监管力度逐渐加大，滥用违禁兽药的现象有所控制，但是出现了使用生物活性相似的替代品代替重点监管兽药的新现象。新型“瘦肉精”福莫特罗与克伦特罗等三种常用“瘦肉精”物质具有同样的促进生长、增加瘦肉率的作用，2002年农业部1519号条例规定食品动物禁止使用β激动剂类药物作为饲料添加剂。福莫特罗检测手段滞后，尤其是快速检测产品缺乏，国家及各省市正在加紧建立新型“瘦肉精”物质的确证方法，同时也急需适合批量、快速筛选的检测产品，满足政府和企业的需要。目前有关福莫特罗残留的检测技术主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)及免疫分析技术，前三种方法灵敏、准确，但操作繁琐，对实验设备和技术要求较高，不适合大批量样品的快速检测。免疫分析方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA)，具有灵敏度高、特异性好、成本低、操作方便等特点，适于大批量样品筛选。GICA作为一种新的免疫学检测方法，既有免疫学方法的特异性，又有简便快速、不需仪器的特点，其在医学、动植物检疫、食品检测等多领域已得到了广泛应用。开发福莫特罗胶体金试纸条有助于福莫特罗残留快速、准确的检测，有效遏制其在水产品中的违规使用及残留超标问题，提高人民群众水产品餐桌质量安全水平。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术缺陷提供一种检测福莫特罗的胶体金免疫层析试纸条，该胶体金免疫层析试纸条具有操作简单，快速，适合大批量样品初筛的优点。此外，本专利技术进一步提供该检测福莫特罗的胶体金免疫层析试纸条的制备方法与应用。本专利技术所述技术问题是由以下技术方案实现的。一种检测福莫特罗的胶体金免疫层析试纸条，该检测试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，试纸两端设有保护膜，所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫依次粘贴于底板上；其中胶体金垫为吸附有胶体金标记的福莫特罗单克隆抗体，包被膜上含有用福莫特罗偶联载体蛋白的预包被检测线(T线)，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液预包被的质控线(C线)，两条线竖直平行排列。上述胶体金免疫层析试纸条，福莫特罗单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，由CCTCCNO:C2016182的杂交瘤细胞株Formoterol-3E6产生。该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株Formoterol-3E6，于2016年10月26日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCNO:C2016182。上述胶体金免疫层析试纸条，所述福莫特罗单克隆抗体由福莫特罗抗原产生，其为由福莫特罗与载体蛋白采用碳二亚胺法合成的偶联物，包括免疫原与检测原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、免疫血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白；免疫原优选载体为牛血清白蛋白，检测原优选载体为卵清蛋白；上述胶体金免疫层析试纸条，所述底板为PVC条或其它不吸水的硬质材料；所述样品垫和胶体金垫由玻璃纤维棉制成；所述吸水垫由吸水滤纸制成；所述包被膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为不透明的胶膜。本专利技术所述的胶体金层析试纸条制备方法，包括如下步骤：(1)制备福莫特罗抗原工作液：(a)活化对氨基苯甲酸的制备：称取6mg亚硝酸钠，溶在0.35mL蒸馏水中，然后称取10mg对氨基苯甲酸，溶入1.1mL1mol/L的盐酸中，冰浴搅拌，将上述亚硝酸钠溶液逐滴加入到对氨基苯甲酸溶液中，避光反应1h，得到活化对氨基苯甲酸；(b)带有羧基的福莫特罗活性中间体的制备：称取福莫特罗30mg溶在5mL、0.05mol/L冰冷的硼砂缓冲溶液中(pH＝9，含0.15mol/L的氯化钠)，冰浴搅拌，将此溶液逐滴加入到活化对氨基苯甲酸溶液中，4℃避光反应3h，得到带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液；(c)免疫原的合成：在上述带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液中加入0.1mol/LNaOH调pH至7.4，将EDC140mg、NHS60mg溶解在2mLPBS中，少量多次加到溶液中室温搅拌3h。称取BSA200mg溶解在1mL0.01mol/L的PBS中，边搅拌边加入上述溶液中，反应过夜后，将偶联物溶液转移至透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72h，然后改用蒸馏水4℃透析48h，每天换液2次。透析后的溶液于6000rmp离心30min，取上清-20℃保存。标记为Formoterol-BSA；(d)检测原的合成：在上述带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液中加入0.1mol/LNaOH调pH至7.4，将EDC140mg、NHS60mg溶解在2mLPBS中，少量多次加到溶液中室温搅拌3h。称取OVA150mg溶解在1mL0.01mol/L的PBS中，边搅拌边加入上述溶液中，反应过夜后，将偶联物溶液转移至透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72h，然后改用蒸馏水4℃透析48h，每天换液2次。透析后的溶液于6000rmp离心30min，取上清-20℃保存。标记为Formoterol-OVA。(2)制备福莫特罗单克隆抗体工作液：(a)动物免疫：选择载体蛋白为牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，间隔2周免疫1次，3次免疫后断尾取血测定效价和抑制率，选择结果最佳的小鼠准备融合；(b)细胞融合：取步骤(a)选定的小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，间接ELISA法测定上清液选取阳性高的孔，通过有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直至建立产生单一抗福莫特罗的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(c)单克隆抗体的大量制备：选取个体较大的雌性Balb/c小鼠，采用体内诱生腹水法，大量制备腹水，并通过辛酸-硫酸铵沉淀纯化腹水，分成小管，-20℃保存，得福莫特罗单克隆抗体；(3)制备胶体金标记的福莫特罗单克隆抗体：将待标记的福莫特罗单克隆抗体溶液10000r/min离心30min，取胶体金溶液10mL，用0.1mol/LK2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2；取等量福莫特罗单克隆抗体溶液，磁力搅拌下与胶体金溶液混合，室温孵育15min，10000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用每升含10gBSA、0.5g叠氮钠、浓度为0.02mol/L的Na2B4O7溶液稀释，即获得胶体金标记的福莫特罗单克隆抗体，4℃保存备用；(4)胶体金垫制备：按规格裁取玻璃纤维棉，将胶体金标记的福莫特罗单克隆抗体用喷金仪均匀喷洒于玻璃纤维棉上，37℃干燥1h，密封，4℃保存备用；(5)检测线和质控线的制备：将福莫特罗抗原放于喷金仪贮存池A，羊抗小鼠IgG溶液放于贮存池B，开机分别点射于膜中央，形成间距0.5c本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测福莫特罗胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，该检测试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，试纸两端设有保护膜；所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫依次粘贴于底板上；其中胶体金垫为吸附有胶体金标记的福莫特罗单克隆抗体，包被膜上含有用福莫特罗偶联载体蛋白的预包被检测线T线，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液预包被的质控线C线，两条线竖直平行排列。

【技术特征摘要】
1.一种检测福莫特罗胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，该检测试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫组成，试纸两端设有保护膜；所述样品垫、胶体金垫、包被膜和吸水垫依次粘贴于底板上；其中胶体金垫为吸附有胶体金标记的福莫特罗单克隆抗体，包被膜上含有用福莫特罗偶联载体蛋白的预包被检测线T线，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液预包被的质控线C线，两条线竖直平行排列。2.根据权利要求1所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述底板为PVC条或其它不吸水的硬质材料；所述样品垫和胶体金垫由玻璃纤维棉制成；所述吸水垫由吸水滤纸制成；所述包被膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜；所述保护膜为不透明的胶膜。3.根据权利要求1所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述福莫特罗单克隆抗体为鼠源单克隆抗体，由CCTCCNO:C2016182的杂交瘤细胞株Formoterol-3E6产生；该杂交瘤细胞株被命名为杂交瘤细胞株Formoterol-3E6，于2016年10月26日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO:C2016182。4.根据权利要求1所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述福莫特罗单克隆抗体由福莫特罗抗原产生，该福莫特罗抗原为由福莫特罗与载体蛋白采用碳化二亚胺法合成的偶联物，包括免疫原与检测原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、鼠血清白蛋白、免疫血清蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或人血清白蛋白。5.根据权利要求4所述的胶体金层析试纸条，其特征在于，所述福莫特罗免疫原使用牛血清白蛋白为载体；所述福莫特罗检测原使用卵清蛋白为载体。6.制备如权利要求1所述检测福莫特罗胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备福莫特罗抗原工作液：(a)活化对氨基苯甲酸的制备：称取6mg亚硝酸钠，溶在0.35mL蒸馏水中，然后称取10mg对氨基苯甲酸，溶入1.1mL1mol/L的盐酸中，冰浴搅拌，将上述亚硝酸钠溶液逐滴加入到对氨基苯甲酸溶液中，避光反应1h，得到活化对氨基苯甲酸；(b)带有羧基的福莫特罗活性中间体的制备：称取福莫特罗30mg溶在5mL、0.05mol/L冰冷的硼砂缓冲溶液中，所述硼砂缓冲溶液pH＝9并且含0.15mol/L的氯化钠，冰浴搅拌，将此溶液逐滴加入到活化对氨基苯甲酸溶液中，4℃避光反应3h，得到带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液；(c)免疫原的合成：在上述带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液中加入0.1mol/LNaOH调pH至7.4，将EDC140mg、NHS60mg溶解在2mLPBS中，少量多次加到溶液中室温搅拌3h；称取BSA200mg溶解在1mL0.01mol/L的PBS中，边搅拌边加入上述溶液中，反应过夜后，将偶联物溶液转移至透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72h，然后改用蒸馏水4℃透析48h，每天换液2次；透析后的溶液于6000rmp离心30min，取上清-20℃保存；标记为Formoterol-BSA；(d)检测原的合成：在上述带有羧基的福莫特罗活性中间体溶液中加入0.1mol/LNaOH调pH至7.4，将EDC140mg、NHS60mg溶解在2mLPBS中，少量多次加到溶液中室温搅拌3h；称取OVA150mg溶解在1mL0.01mol/L的PBS中，边搅拌边加入上述溶液中，反应过夜后，将偶联物溶液转移至透析袋，在PBS缓冲液中4℃透析72h，然后改用蒸馏水4℃透析48h，每天换液2次；透析后的溶液于6000rmp离心30min，取上清-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春生，李玉静，刘静静，吴萌，李亚璞，程华，陈英珠，
申请(专利权)人：河北省科学院生物研究所，石家庄科品生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13