牛布鲁氏菌参考血清库制造技术

本发明专利技术涉及一种牛布鲁氏菌参考血清库。本发明专利技术的意义在于：(1)在国际上率先建成了具有一定规模的牛布鲁氏菌参考血清库；(2)为布鲁氏菌病诊断方法的科学评价提供了残酷物质；(3)为开发针对牛的各类布鲁氏菌病诊断方法提供了物质基础。

Brucella serum Reference Library

The invention relates to a Brucella serum reference library. The present invention is the meaning of: (1) first built in the Brucella reference serum library with a certain scale in the world; (2) provide material for scientific evaluation of cruel brucellosis diagnostic methods; (3) for the material basis for the development of diagnostic method for all kinds of cattle of brucella.

【技术实现步骤摘要】
牛布鲁氏菌参考血清库
本专利技术涉及一种牛布鲁氏菌病参考血清库，属生物制品

技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。布病在世界存在已有久远的历史，人类对该病的研究认识逐步加深，对布病的诊断方法在不断完善，准确率不断提高。总体上，布鲁氏菌诊断方法主要包括抗原诊断法和抗体诊断法，一般实验室，主要通过检测动物体内的布鲁氏菌抗体来判断动物是否感染布鲁氏菌。布鲁氏菌血清学方法不仅包括传统的凝集试验(如：虎红抗原平板凝集试验、试管抗原凝集试验、乳环凝集试验)，还包括敏感性高、特异性强的ELISA方法、荧光偏振试验(FPA)、胶体金试纸条等新的检测技术。凝集试验是布鲁氏菌病诊断的一种常用的方法，包括血清凝集实验、乳环沉淀试验和抗人免疫球蛋白试验，其中经典的标准试管凝集试验(STAT)、平板凝集试验(PAT)，以上方法在发达国家已经基本停止使用，取而代之的是缓冲布鲁氏菌抗原凝集试验如虎红平板凝集试验(RBPT)。虎红平板凝集抗原是用抗原性良好的布鲁氏菌菌株经培养，灭活，离心收集菌体后用虎红染料染色后悬浮于乳酸缓冲液中制成，该方法灵敏度高，价格便宜，操作方便，检测快速，适于动物群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检测的指定试验，在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。乳环沉淀试验依然是乳牛布鲁氏菌监测的主要方法，该方法直接对牛乳进行检测，可以对奶牛群体进行筛检，该方法简便快速。在布鲁氏菌病血清学检验中一致认为补体结合试验(CFT)在特异性上优于其他方法，常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试验检测为阳性或可疑的病例进行定性检测。补体结合试验一直被认为是最有效的布病诊断方法，至今尚没有一种诊断方法能取代补体结合试验在血清学诊断中的地位。但补体结合试验所需要的溶血素的制备困难，试验操作繁琐，难以在临床上普遍使用，而且由于猪体内的补体会干扰豚鼠补体的作用，导致敏感性下降。ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法，该方法操作方便，灵敏度高，特异性较好，一次可以完成大量样品的检测，既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫，还可以作为确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测，还可应用于乳样中抗体的检测。牛的布鲁氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一，其他种布鲁氏菌的ELISA检测方法也是研究的热点。目前，常用于牛布鲁氏菌病检测的血清学方法主要包括：试管凝集试验(STAT)、虎红平板凝集试验((RBPT)、补体结合试验(CFT)、牛布鲁氏菌间接ELISA(iELISA)检测试剂盒、布鲁氏菌竞争ELISA(cELISA)抗体检测试剂盒、荧光偏振(FPA)诊断方法。不同血清学诊断方法各有其优缺点，如何客观评价各种血清学诊断方法的特异性和敏感性评价，离不开具有一定规模、具有代表性的、背景清楚的血清样本库。牛布鲁氏菌参考血清库为评价各种针对牛布鲁氏菌病血清学诊断方法奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过收集或制备具有一定规模、一定代表性的、背景清楚的牛布鲁氏菌不同感染状态(自然感染、疫苗免疫、健康)的血清，经分装冻干和各种血清学检测，建成牛布鲁氏菌参考血清库，为布鲁氏菌病血清学诊断方法的科学评价提供参考血清。本专利技术的技术方案1.牛布鲁氏菌参考血清库，其特征在于含有自然感染的牛布鲁氏菌病阳性血清30份以上；疫苗免疫的牛布鲁氏菌病阳性血清30份以上；布鲁氏菌病阴性血清30份以上；牛抗大肠杆菌O157血清、牛抗小肠结肠炎耶尔森氏菌O9血清、牛抗都柏林沙门氏菌血清、牛抗粗糙型布鲁氏菌血清各2份以上；本血清库可为各类牛布鲁氏菌病血清学诊断方法的评价提供参考物质，其中：(1)血清库中各份血清均精确分装，并冻干保存，每份血清的冻干样本数大于10，满足不同时间使用的可重复性；(2)血清库中的布鲁氏菌阳性血清、布鲁氏菌阴性血清是指用虎红平板凝集试验、试管凝集试验以及补体结合试验等方法共同确认的血清；(3)大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、柏林沙门氏菌、粗糙型布鲁氏菌易于布鲁氏菌抗体产生交叉反应，血清库中的牛抗大肠杆菌O157血清、牛抗小肠结肠炎耶尔森氏菌O9血清、牛抗柏林沙门氏菌血清、牛抗粗糙型布鲁氏菌血请是用相应细菌培养物人工免疫绵羊制备而成，用以评价各种血清学诊断方法的特异性。2.权利要求1所述的牛布鲁氏菌参考血清库的应用，其特征在于使用该血清库的参考血清能对各种牛布病血清学诊断方法的特异性和敏感性进行科学评价。本专利技术具体实施方式本专利技术采用收集不同背景来源(自然感染、疫苗免疫、健康群体)的牛血清，经过虎红平板凝集试验(RBPT)初步检测，再经试管凝集试验(SAT)进行效价测定，以及补体结合试验(CFT)确诊，小量分装冻干后，分别作为牛布鲁氏菌阳性参考血清、牛布鲁氏菌疫苗免疫阳性参考血清、牛布鲁氏菌阴性参考血清。制备易干扰布病血清学诊断的其它革兰氏阴性菌的高免血清，主要包括牛抗小肠结肠炎耶尔森氏菌O9阳性血清、牛抗大肠杆菌O157阳性血清、牛抗柏林沙门氏菌阳性血清、牛抗粗糙型布鲁氏菌阳性血清。上述血清小量分装冻干后，作为布鲁氏菌特异性阴性参考血清(质控阴性血清)。将上述背景清楚、精确分装冻干的血清作为牛布鲁氏菌参考血清库，用于对牛布鲁氏菌病血清学诊断方法进行特性和敏感性评价。本血清库为各种牛布病血清学诊断方法评价提供了必要的物质基础。1.筛选临床上布病阳性牛作为阳性血清样本来源。采用虎红平板凝集试验分别对山东地区有流产史的奶牛场进行布病抗体检测，对检测到的阳性血清，分别用试管凝集试验进行效价测定，同时用补体结合试验进行确诊。对确诊为布病阳性的牛，采集更多血清，并试管凝集试验重新测定效价。将各血清0.5ml/支分装冻干。2.跟踪监测免疫牛群抗体水平，采集血清作为布病疫苗免疫的阳性血清样本来源。采用布鲁氏菌病疫苗(S2株)对试验奶牛进行口服免疫，500亿CFU/头份。免疫完成后采用虎红平板凝集试验每周监测抗体水平，在抗体水平价高阶段收集部分羊的血清，按照临床阳性血清样本制备方法进行效价测定和补体结合试验确诊。将各血清0.5ml/支分装冻干。3.监测健康奶牛群布病抗体情况，采集抗体阴性羊的血清作为阴性参考血清样本来源。对未发生流产、且未免疫布病疫苗的奶牛场进行抗体监测，选择虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验均检测为阴性的奶牛，制备阴性参考血清。将各血清0.5ml/支分装冻干。4.制备小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157、都柏林沙门氏菌、粗糙型布鲁氏菌等易与光滑型布鲁氏菌抗血清产生干扰的革兰氏阴性菌灭活抗原，免疫试验牛，制备相应的抗血清，作为牛布鲁氏菌特异性阴性参考血清样本来源。将各血清0.5ml/支分装冻干。5.建立上述各种血清的背景档案。本专利技术涉及生物材料资源信息小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia.enterocolitica)O9W22703株(徐云本文档来自技高网...

【技术保护点】
牛布鲁氏菌参考血清库，其特征在于含有自然感染的牛布鲁氏菌病阳性血清30份以上；疫苗免疫的牛布鲁氏菌病阳性血清30份以上；布布鲁氏菌阴性血清30份以上；牛抗大肠杆菌O157血清、牛抗小肠结肠炎耶尔森氏菌O9血清、牛抗柏林沙门氏菌血清、牛抗粗糙型布鲁氏菌血清各2份以上；本血清库可为各类牛布鲁氏菌病血清学诊断方法的评价提供参考物质，其中：(1)血清库中各份血清均精确分装，并冻干保存，每份血清的冻干样本数大于10，满足不同时间使用的可重复性；(2)血清库中的布鲁氏菌阳性血清、布鲁氏菌阴性血清是指用虎红平板凝集试验、试管凝集试验以及补体结合试验等方法共同确认的血清；(3)大肠杆菌O157、小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、柏林沙门氏菌、粗糙型布鲁氏菌易于布鲁氏菌抗体产生交叉反应，血清库中的牛抗大肠杆菌O157血清、牛抗小肠结肠炎耶尔森氏菌O9血清、牛抗柏林沙门氏菌血清、牛抗粗糙型布鲁氏菌血清是用相应细菌培养物人工免疫绵羊制备而成，用以评价各种血清学诊断方法的特异性。

【技术特征摘要】
1.牛布鲁氏菌参考血清库，其特征在于含有自然感染的牛布鲁氏菌病阳性血清30份以上；疫苗免疫的牛布鲁氏菌病阳性血清30份以上；布布鲁氏菌阴性血清30份以上；牛抗大肠杆菌O157血清、牛抗小肠结肠炎耶尔森氏菌O9血清、牛抗柏林沙门氏菌血清、牛抗粗糙型布鲁氏菌血清各2份以上；本血清库可为各类牛布鲁氏菌病血清学诊断方法的评价提供参考物质，其中：(1)血清库中各份血清均精确分装，并冻干保存，每份血清的冻干样本数大于10，满足不同时间使用的可重复性；(2)血清库中的布鲁氏菌阳性血清、布鲁氏菌阴性血清是指用虎红平...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁家波，蒋卉，朱良全，彭小薇，冯宇，张磊，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11