一种检测血清样本中登革热抗体的蛋白悬浮芯片及其制备方法和使用方法技术

本发明专利技术涉及一种检测血清样本中登革热病毒抗体的蛋白悬浮芯片及其制备方法和使用方法。本发明专利技术的方法检测能力好、灵敏度高、特异性强、动态范围宽，并建立了以登革热抗体为代表的病毒抗体蛋白悬浮芯片检测的开放性检测模式化平台。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测血清样本中登革热病毒抗体的蛋白悬浮芯片及其制备方法 和使用方法。
技术介绍
登革热是登革热病毒引起、依蚊传播的一种急性传染病。临床特征为起病急骤，高 热，全身肌肉、骨髓及关节痛，极度疲乏，部分患可有皮疹、出血倾向和淋巴结肿大。登革热 病毒属B组虫媒病毒，现在归入披盖病毒科(togaviridae)黄热病毒属(flavivirus)。病 毒颗粒呈哑铃状(700X20 40nm)、棒状或球形(直径为20 50nm)。髓核为单股线状核 糖核酸(RNA)。病毒颗粒与乙型脑炎病毒相似，最外层为两种糖蛋白组成的包膜，包膜含有 型和群特异性抗原，用中和试验可鉴定其型别。登革病毒可分为4个血清型，与其他B组虫 媒病毒如乙型脑炎病毒可交叉免疫反应。免疫学方法酶联免疫实验(ELISA)中利用抗原与抗体特异性反应来检测抗原或 抗体主要有由双抗原夹心测抗体、双抗体夹心测抗原、竞争法、间接法等。间接法测抗体 的原理是特异性抗原结合到固相载体上，然后和待检血清中的相应抗体结合形成免疫复合 物，洗涤后再加酶标记抗体与免疫复合物中的抗体结合形成酶标记抗体_抗体_固相抗原 复合物，加底物显色，判断抗体含量。悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片，是20世纪70年代美国Luminex公 司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平 台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。目前，该技术已广泛应用于免疫分析、核酸 研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。目前发展的悬浮芯片主要是基于实验室检测方法的建立和方法评价及优化，以缩 短检测时间，降低方法的检测成本。但是悬浮芯片是否能够检测人血清中的登革热抗体，其 定量检测能力如何，尚缺乏模型和评价。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测血清中登革热抗体的蛋白悬浮芯片，该芯片包 括编码微球、登革热E2蛋白抗原、标准品、待检样品、生物素标记的二抗、链亲和素-藻红 蛋白，及相关的缓冲溶液，悬浮芯片系统检测荧光值。本专利技术提供上述检测血清样本中登革热抗体的蛋白悬浮芯片的制备方法，具体 为编码微球为带有羧基的微球，用登革热E2蛋白包被编码微球，鼠抗登革热IgG为标准 品、人血清样品作为待检样品、生物素标记的检测物为生物素化的SPA(Biotin-SPA)和生 物素化羊抗鼠IgG、用链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)作为荧光信号检测物，以上试剂均用相 关缓冲溶液稀释，所述编码微球优选031号羧基编码微球。本专利技术提供一种采用上述蛋白悬浮芯片检测血清样本中登革热抗体的间接免疫学检测方法，在检测过程中所有反应可在96微孔滤板上或在微量离心管中进行，其中包括 下列步骤(1)将登革热E2蛋白抗原作为捕获抗原来包被编码微球；(2)每孔或管中加入 含有已包被捕获抗原，即登革热E2蛋白抗原包被的编码微球的工作溶液，用清洗液清洗； (3)加入待测血清样品，孵育后清洗；(4)加入用生物素化的检测物，孵育后清洗；(5)加入 链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)，孵育后清洗，(6)加入检测缓冲液后混勻，(7)用悬浮芯片系 统读取MFI数值(即平均荧光强度)并分析数据判定检测结果阴性或阳性。该方法中，采用生物素标记的SPA作为检测抗体，并且其与登革热E2蛋白的 组合组成间接法检测体系；包被编码微球的捕获抗原登革热E2蛋白抗原用量为0. 1 ΙΟΟμ g/1. 25X IO6个编码微球或0. 02 400ng/2500 5000个微球/测试；标记检测 抗体SPA的生物素为羧基活性的生物素，并采用2mg/mL生物素化的检测抗体Bio-SPA以 1 2500稀释作为检测抗体进行检测。本专利技术还提供一种采用上述蛋白悬浮芯片定量检测血清样本中登革热抗体的方 法，该方法包括下列步骤(1)加入的阳性检测样品或标准品经4倍梯度倍比稀释，(2)将系 列稀释样品在悬浮芯片系统中检测读取对应荧光值(MFI) ； (3)制作样品浓度对应MFI值的 剂量-反应标准曲线，(4)用分析软件拟合剂量-反应曲线和方程，(5)可根据剂量-反应 曲线判定方法的动态检测范围，未知浓度样品可根据剂量-反应方程计算出检测样品的浓 度。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比 例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗 微球大小约5. 6 μ m，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分 析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。其在以下悬浮芯片 系统中完成检测，标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应，反应后，利用机器自动 将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中 设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目； 一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定 微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可被检测到。而若样本中不含该标的物， 则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的 微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待 测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。悬浮芯片技术由于利用微球在溶液中反应， 克服了片膜芯片在大分子检测时受表面张力、空间效应等对反应动力学的影响，同时利用 激光检测技术，大大提高了样品检测的准确性和重复性，具有优于片膜芯片的操作简便、重 复性好等特点。本专利技术人经过大量和深入的研究，对登革热抗体的蛋白悬浮芯片制备及其检测条 件作了实质性的改进和创新，其具有下列优点1、抗原包被量的改进登革热E2蛋白的包被量是否合适是成功检测的关键，本专利技术对包被微球的抗原 包被量进行实质性优化使血清样本的检测效果非常良好，并且包被悬浮芯片所需的抗原 包被量很低，本专利技术的登革热E2蛋白抗原包被量为0. 1 100 μ g/1. 25X IO6个微球，即 0. 02 400ngl·! g/2500 5000个微球/测试，而一般的ELISA试验所需抗原的包被量为4lyg/测试。2、生物素标记的改进通常，标记抗体需要使用过量的生物素。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素 因未标记上抗体而不被微球上结合捕获抗体的抗原连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加 入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能过高的现 象，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。以标记2mg/mL的IgG(分子量 150，000) ImL溶液为例，需加入IOmM生物素溶液约27 μ L。3、检测的灵敏度及动态范围本专利技术的血清样品登革热抗体的蛋白悬浮芯片定量检测方法和悬浮芯片的灵敏 度为18. 3ng/mL ；并且悬浮芯片方法动态检测范围为4. 14 265ng/mL。4、方法的特异性本专利技术通过选用登革热的E2蛋白为包被抗原，以鼠抗登革热IgG为待测抗体，以 生物素化-SPA为检测物。本研究试验证明，在存在兔抗土拉血清、兔抗禽流感H5血清、兔 抗西尼罗抗体等干扰抗体存在条件下本方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测血清样本中登革热抗体的蛋白悬浮芯片，其特征在于，该芯片包括：编码微球，作为包被微球抗原是登革热Ｅ２蛋白抗原，生物素标记的羊抗鼠ＩｇＧ和／或ＳＰＡ作为检测抗体，链亲和素－藻红蛋白作为信号检测物和相关缓冲溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，杨永莉，杨宇，孙肖红，胡孔新，曹晓梅，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]