本发明专利技术为重组抗原HCMV pp150用于 ELISA捕获法检测人血清HCMV IgM抗体试剂盒，涉及一种新的辣根过氧化物酶标记重组HCMV pp150抗原的制法以及在其基础上制备用于检测人血清中HCMV IgM抗体的ELISA试剂盒。所述方法包括采用基因工程方法制备特异性重组HCMV pp150抗原、重组HCMV pp150抗原辣根过氧化物酶标记、抗人IgM μ链抗体包被酶标反应板的制备以及ELISA试剂盒的组装。与其它市售ELISA试剂盒相比本发明专利技术特异性为100%，敏感性为95.6%，均优于国内某公司的HCMV IgM试剂盒（分别为95.6%和86.9%）。主要供实验室研究和临床辅助诊断HCMV活动性感染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属基因工程技术、诊断试剂领域，尤其涉及一种ELISA检测人血清HCMV pp150 IgM抗体试剂盒。
技术介绍
人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)属于人类疱疹病毒β亚科病毒，在人群中的感染极为普遍，呈世界性分布，血清流行病学调查表明，40-100％成人有HCMV抗体。目前的研究表明HCMV是人类先天性感染最常见的病原体之一，对孕妇及胎儿影响巨大，孕期的HCMV原发感染危害尤为巨大，2/3先天性感染是由孕期原发感染造成的。先天性感染中90％的患儿不表现临床症状，5％-10％可造成流产、死胎、胎儿畸形、发育迟缓及迟发性中枢神经系统缺陷等疾病。此外，HCMV感染也是器官移植失败和艾滋病病人并发感染死亡的主要原因之一。快速准确的诊断和监测HCMV感染状态的方法在临床上是急需的，在一些特定的人群中尤为重要，比如器官移植手术中的供体和受体，育龄妇女以及接受免疫抑制剂治疗的人群等。HCMV在免疫力正常人群中通常呈现无症状感染，病毒复制受到抑制，有间歇性排毒现象存在。而在HCMV活动性感染中，病毒大量复制，可在血液，尿液，脑脊液等检测到活病毒。病毒分离是诊断HCMV活动性感染最重要的指标之一。但是由于病毒自身的复制特点，病毒分离实验周期较长。而且病毒分离实验本身操作繁琐，对实验条件，设备有一定的要求，不适用于临床对该病毒的及时监测及诊断。血清中HCMV特异的IgM抗体是诊断新近感染的重要指标，IgM抗体在机体病毒原发感染3-5天即可出现，持续12-16周时间。采用ELISA试剂盒检测HCMV特异的IgM抗体，检测方法简单，实验周期短，可重复性高，适用于临床诊断。捕获法用于检测血清中HCMV特异的IgM抗体原理是，采用抗人IgMμ链特异性单克隆抗体包被酶标反应板，能与血清中的IgM抗体特异性结合。再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗原，加入底物反应一定的时间并终止反应。在一定的范围内，吸光度值(OD)的大小体现血清样品中IgM抗体的含量多少。相对于间接法，捕获法不受血清中高滴度的IgG抗体影响，特异性更好。HCMV pp150是疱疹病毒β亚科特有基因，在HCMV众多结构蛋白质中pp150是免疫原性最强的，是刺激机体产生体液免疫的主要靶抗原，也是杀伤性T淋巴细胞(CTL)主要识别抗原。在病毒感染的恢复期，血清中针对pp150的抗体存在时间较针对其他抗原的抗体存在时间长。HCMV pp150还是能够刺激机体产生IgM为数不多的CMV抗原之一。因此采用该蛋白作为捕获法酶标抗原不仅可以保证检测方法的可靠性还可以减少疱疹病毒之间的交叉反应，从而提高检测方法的特异性。通过缺失突变株的构建证实pp150对病毒在细胞质中的包装成熟至关重要，pp150缺失突变株基因复制能够正常进行，但是病毒不能完成最终的包装，也不能够感染邻近的细胞。完整的pp150由1048个氨基酸组成，含有多个抗原表位。但是通过截短表达或者单独表达这些抗原表位发现，他们并不是都能够和CMV阳性血清反应。已有的研究还表明，单纯的串联表达同一抗原表位不能够增强该抗原的免疫原性和免疫反应性，而将不同的抗原表位串联表达可以很好的增强其免疫原性和免疫反应性。鉴于此，我们采用融合PCR的方法，将HCMVpp150的两个优势抗原表位(肽段aa495-691，aa862-1048)的编码区域直接连接起来插入pET32(b)表达载体，导入大肠埃希氏菌BL21(DE3)。经诱导表达获得截短pp150蛋白。用该蛋白作为捕获法检测IgM抗体的ELISA试剂盒的酶标抗原，包装的试剂盒与德国DiaSorin公司的HCMV IgM检测试剂盒以及国内某公司的HCMV IgM试剂盒比较。以德国DiaSorin公司的HCMV全病毒包装IgM检测试剂盒做为标准，结果显示：本项目专利技术试剂盒特异性为100％，敏感性为95.6％，均优于国内某公司的HCMV IgM试剂盒(分别为95.7％和86.9％)。敏感性虽略低于德国DiaSorin公司的HCMV全病毒包装IgM检测试剂盒(100％)，但是特异性高于德国DiaSorin公司的HCMV全病毒包装IgM检测试剂盒(98.9％)。
技术实现思路
本专利技术的目的是现有临床检测技术的不足，提供一种通过ELISA方法快速检测样品中HCMV IgM抗体的试剂盒。为了实现上述目的本专利技术采用如下技术方案：一种ELISA检测人血清HCMV pp150 IgM抗体试剂盒，其特征在于：使用的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的重组蛋白HCMV pp150。所述的一种ELISA检测人血清HCMV pp150 IgM抗体试剂盒，其特征在于：所述的辣根过氧化物酶标记的重组蛋白HCMV pp150的制备方法为：A、HCMV pp150重组蛋白获取 (1)根据Genebank中已公布的HCMV基因序列，确定HCMV pp150基因编码序列，设计用于扩增aa495-691和aa862-1048的融合PCR引物，以HCMV AD169株DNA为模板，扩增出的目的片段大小为1155bp，将其克隆到pET32b载体上，构建重组质粒pET32b/pp150，在通过DNA测序获得HCMV pp150基因核酸序列正确的重组载体，转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS－PAGE蛋白电泳及Western blotting鉴定；(2)将表达HCMV pp150重组蛋白的大肠杆菌经过大量培养至对数期，加IPTG诱导5小时，离心收集菌体，破碎后12000rpm超速离心30min收集上清，亲和层析纯化后得到大量HCMV pp150重组蛋白；B、辣根过氧化物酶标记抗原重组蛋白HCMVpp150(1)称取4.8-5.2mgHRP溶解于0.8-1.2ml蒸馏水中； (2)于步骤(1)所得溶液中加入0.15-0.25ml新配的0.05-0.15M的NaIO4溶液，室温下避光搅拌15-25分钟；(3)将步骤(2)所得溶液溶液装入透析袋中，对0.5-1.5mM PH4.3-4.5的醋酸钠缓冲液透析，3-5℃下放置6-8小时，得醛化HRP；(4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg纯化后的HCMV pp150重组蛋白在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；(5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再于4℃下放置2小时；(6)将上述溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜；(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃下放置1小时；(8)3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于5ml 0.15M PH7.4的PBS中；(9)将上述溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为辣根过氧化物酶标记抗原重组蛋白HCMVpp1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ELISA检测人血清HCMV pp150 IgM抗体试剂盒，其特征在于：使用的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的重组蛋白HCMV pp150。
【技术特征摘要】
1.一种ELISA检测人血清HCMV pp150 IgM抗体试剂盒，其特征在于：使用的酶标抗原是辣根过氧化物酶标记的重组蛋白HCMV pp150。
2.根据权利要求1所述的一种 ELISA检测人血清HCMV pp150 IgM抗体试剂盒，其特征在于：所述的辣根过氧化物酶标记的重组蛋白HCMV pp150的制备方法为：
A、HCMV pp150重组蛋白获取
（1）根据Genebank中已公布的HCMV基因序列，确定HCMV pp150基因编码序列，设计用于扩增aa495-691和aa862-1048的融合PCR引物，以HCMV AD169株DNA为模板，扩增出的目的片段大小为1155bp，将其克隆到pET32b载体上，构建重组质粒pET32b/pp150，在通过DNA测序获得HCMV pp150基因核酸序列正确的重组载体，转化大肠杆菌BL21(DE3), 经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS－PAGE蛋白电泳及Western blotting鉴定；
（2）将表达HCMV pp150重组蛋白的大肠杆菌经过大量培养至对数期，加IPTG诱导5小时，离心收集菌体，破碎后12000rpm超速离心30min收集上清，亲和层析纯化后得到大量HCMV pp150重组蛋白；
B、辣根过氧化物酶标记抗原重组蛋白HCMVpp150
（1）称取4.8-5.2mgHRP溶解于0.8-1.2ml蒸馏水中；
（2）于步骤（1）所得溶液中加入0.15-0.25ml新配的0.05-0.15M 的NaIO4溶液，室温下避光搅拌15-25分钟；
（3）将步骤（2）所得溶液溶液装入透析袋中，对0.5-1.5mM PH4.3-4.5的醋酸钠缓冲液透析，3-5℃下放置6-8小时，得醛化HRP；
（4）加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg 纯化后的HCMV pp150重组蛋白在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；
（5）加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再于4℃下放置2小时；
（6）将上述溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜；
（7）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4...
【专利技术属性】
技术研发人员：王明丽，张文昌，刘峰，
申请(专利权)人：王明丽，安徽博睿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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