本发明专利技术公开了一种抗CBir1抗体层析试纸条、制备方法及应用。该试纸条包括样品垫(1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫(6)、底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5)，所述底板(7)的上部贴合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的两端分别贴合有结合垫(2)和吸水垫(6)，结合垫(2)上部的一端贴合有样品垫(1)，检测带T线(4)和质控带C线(5)设置在分析膜(3)上。本发明专利技术用CBir1抗原蛋白，实现对样本中抗CBir1抗体的高灵敏度、高特异性快速检测，为临床克隆恩病等自体免疫性疾病的辅助诊断提供依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及免疫分析检测领域。具体而言，本专利技术涉及一种检测CBir1的免疫层析检测试纸的制备方法及应用。
技术介绍
IBD是北美和欧洲的常见病，近30年来日本IBD发病率亦呈逐步增高趋势，我国虽尚无普通人群的流行病学资料，但近10多年来本病就诊人数呈逐步增加趋势则非常明显。IBD的临床表现复杂多样，不仅有消化道症状，还可有肠外表现。由于症状为腹痛、腹泻、便血等非特异性肠炎表现，CD与UC，以及IBD与结核性肠炎等其他肠道慢性疾病很难鉴别诊断。 目前鉴别UC与CD的生物标志物主要集中在自身免疫抗体与抗微生物抗体，CBirl是从一种自发产生结直肠炎的C3H/HeJBir大鼠的血清学发现的细菌鞭毛蛋白。研究证明CBirl参与多种炎症反应，其机制与核因子NF-KB的激活有关。近来研究发现，CBirl与某些非典型克隆恩病的发病有关，是克隆恩病相关抗原。CBirl能分别与来自克隆恩病患者和结直肠炎大鼠的血清蛋白IgG发生反应，而与正常人IgG无反应。这些鞭毛蛋白的序列已被证明含有种族发育结构功能保守的氨基末端和羧基末端，而且还附有一个具预测功能的类似沙门氏菌fliC基因的三维结构，其上带有一个完整的TLR5结合位点。结合对鞭毛蛋白在大鼠和人体上激发的免疫应答有限性的研究，提示CBir1对宿主细菌在肠道内的慢性炎症的诱发和维持起了重要作用。通过对CBir1的血清反应来识别克隆恩病，发现其与复杂的克隆恩病患者的异常亚型有关；通过利用来自结肠炎大鼠的血清以及与来自大鼠盲肠细菌的DNA噬菌体基因库的血清学表达克隆分化，发现CBirl的血清学免疫应答的优势；当把表达CBirl的内源性细菌菌株转移入重度免疫缺陷大鼠体内时，CBirl激发的CD4+Thl细胞株能诱发结肠炎，提示CBirl在大鼠结肠炎中是免疫显性的。而在克隆恩病中，Thl细胞被过度激活，产生大量的Thl型细胞因子(如：TNF-a、IFN一7、IL-12等)，导致过度的炎症和肠道黏膜的损伤。所以，CBirl与肠道炎症，特别是与克隆恩病之间存在一定的相关性。克隆恩病是一种机体直接针对共生肠道菌群产生异常免疫应答的疾病，并且证明了共生肠道鞭毛蛋白是克隆恩病免疫应答相关的特殊抗原靶位点。因此提示CBirl不仅可通过激活TLR5表达而引起炎症，而且还可能在获得性免疫反应中起到一定的作用，从而维持克隆恩病的慢性炎症的特征。 抗CBirl抗体是在IBD大鼠模型上被发现的引起结直肠炎的第1个细菌抗原抗体，可以导致IBD患者发生病理上的免疫应答。抗CBirl抗体检测的临床意义研究已发现针对CBirl的血清抗体的存在标记克隆恩病的一类亚群。 免疫层析法(immunochromatography)是近几年来兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的纤维素一端浸入样品(尿液或血清)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，形成肉眼可见的检测带。现有的免疫层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、彩色胶乳等等，其中以纳米金应用最为广泛，纳米金也称为胶体金。 以胶体金作为失踪标记物的免疫层析技术特称为免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique，GICT)。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态而得名。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 表面带活性基团的彩色胶乳微球也可以作为免疫层析的示踪剂，与胶体金技术一样，彩色胶乳标记免疫层析技术也具有操作简便、试剂稳定、快速出结果、可室温保存等优点。彩色胶乳标记是将不同直径范围0.1um-1um彩色胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等酯类或其他大分子物质共价结合，使这些大分子标记上颜色，当在检测线或质控线上富集停留后形成肉眼可见的彩色条带。 与现有技术ELISA和化学发光法相比，免疫层析法检测的优点主要包括：(1)使用方便快速，便于基层使用和现场使用，所有反应能在20分钟内完成；(2)成本低，不需要特殊的仪器设备；(3)应用范围广，可适应多种检测条件；(4)可以进行多项检测，若阳性样本比较难获得，多项检测可以节省样品，降低成本；(5)标记物稳定，标记样品在4℃贮存两年年以上，无信号衰减现象；(6)胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。 在IBD诊断方面，基于抗CBir1抗体检测的试剂已经用于商业用途的只有美国Promethues实验室的ELISA试剂，以及本公司开发的化学发光试剂，抗CBir1的免疫层析试纸在国内外市场上仍没有问世。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足，将免疫层析法应用到抗CBir1 抗体的检测中，通过把CBir1抗原蛋白包被在结合垫或分析膜的检测带上，实现对样品中抗CBir1抗体的高特异、高灵敏度、高准确性的检测，快速筛查抗CBir1抗体阳性标本，为临床UC等自体免疫性疾病提供快速的辅助诊断。 本专利技术的目的之一在于提供一种快速、准确的抗CBir1抗体的免疫层析检测试纸条及制备方法，目的之二是提供一种基于免疫层析技术的抗CBir1抗体检测方法。 作为本专利技术第一个方面的一种抗CBir1抗体的免疫层析检测试纸条，包括样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫和底板，分析膜上设置检测带和质控带，所述底板的上部贴合有分析膜，分析膜上部的两端分别贴合有结合垫和吸水垫，结合垫上部的一端贴合有样品垫。 所述的结合垫结合胶体金标记蛋白或彩色胶乳标记蛋白；所述的结合垫为1层(图1)或 2层(图2)，其中2层时错落与分析膜搭接。 所述抗CBir1抗体的免疫层析检测试纸条的制备方法，包括以下步骤： 步骤1.CBir1抗原蛋白的制备 步骤2.结合垫(2)制备 (1)纳米金标记物的制备：用20～40nm粒径的纳米金溶液标记CBir1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G)，以及其他与质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。 (2)彩色胶乳标记物的制备：用带活性氨基或羧基基团的彩色胶乳标记CBir1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G)，以及其他与质控带C线能形成免疫复合物的蛋白。 (3)结合垫(2)制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，先用含BSA和糖的缓冲液预处理并烘干，将步骤(1)制备的纳米金标记物或胶乳标记物，用本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗CBir1抗体免疫层析试纸条，包括样品垫(1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫(6)、底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5)，所述底板(7)的上部贴合有分析膜(3)，所述分析膜(3)上部的两端分别贴合有结合垫(2)和吸水垫(6)，所述结合垫(2)上部的一端贴合有样品垫(1)，所述检测带T线(4)和质控带C线(5)设置在分析膜(3)上，其特征在于，CBir1抗原蛋白结合在结合垫(2)上或包被在检测带T线(4)上。
【技术特征摘要】
1.一种抗CBir1抗体免疫层析试纸条，包括样品垫(1)、结合垫(2)、分析膜(3)、吸水垫(6)、
底板(7)、检测带T线(4)和质控带C线(5)，所述底板(7)的上部贴合有分析膜(3)，所
述分析膜(3)上部的两端分别贴合有结合垫(2)和吸水垫(6)，所述结合垫(2)上部
的一端贴合有样品垫(1)，所述检测带T线(4)和质控带C线(5)设置在分析膜(3)
上，其特征在于，CBir1抗原蛋白结合在结合垫(2)上或包被在检测带T线(4)上。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于：所述的结合垫(2)包被胶体金标
记物或胶乳(乳胶)标记物。
3.根据权利要求1所述的CBir1抗体检测试纸条，其特征在于，所述的结合垫为1层(图1)
或2层与分析膜错落搭接(图2)。
4.一种抗CBir1抗体免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
步骤1.CBir1抗原蛋白的制备
步骤2.结合垫(2)制备
(1)胶体金标记物的制备：用纳米金溶液标记CBir1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡萄球
菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G)，以及其他与检测带T线或质控带C线能形成免
疫复合物的蛋白。
(2)胶乳标记物的制备：用带活性基团的胶乳标记CBir1抗原蛋白、抗人IgG抗体、葡
萄球菌A蛋白(SPA)、链球菌G蛋白(Protein G)，以及其他与检测带T线或质控带C线能形
成免疫复合物的蛋白。
(3)结合垫(2)制备：玻璃纤维膜或聚脂膜作为结合垫，将步骤(1)制备的胶体金标
记物或胶乳标记物，喷涂在预处理的玻璃纤维膜或聚脂膜上，干燥备用。
步骤3.分析膜(3)制备
A.检测带T线(4)制备：根据结合垫标记蛋白类型选择检测带T线包被蛋白，如结合
垫上的结合蛋白含CBir1，检测带T线的包被蛋白是抗人IgG抗体。如果结合垫上含有抗人
IgG抗体，检测带T线包被蛋白为CBir1抗原蛋白。
B.质控带C线(5)制备：根据结合垫的标记蛋白类型选择质控带的包被蛋白，如结合
垫...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈菲，霍如松，周阳，钱洋，
申请(专利权)人：苏州和锐医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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