检测液体样品中抗体的方法技术

本发明专利技术涉及评价患者免疫状态的方法，包括下列步骤：１）利用免疫测定法测定患者液体样品中抗体的含量，其中样品抗体与抗原、抗体或半抗原形式的配体之间的反应是在样品其它成分的存在下进行的，该配体是指向样品抗体的Ｆａｂ区的，得到测量结果１，２）利用免疫测定法测定液体样品中抗体的含量，其中样品抗体与抗原、抗体或半抗原形式的配体之间的反应是在没有样品其它成分的存在下进行的，该配体是指向样品抗体的Ｆａｂ区的，得到测量结果２，以及３）使测量结果１和２相互关联，以表达干扰作用，并用该干扰作用作为参数，用于评价患者的免疫状态。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及检测液体样品中特异性抗体的方法。现有技术WO 94/11734描述了抗体的双部位免疫测定法，该方法采用化学发光标记和生物素结合配体，所述方法包括如下步骤(a)将液体样品与与生物素或其功能衍生物结合的配体抗原、抗体或半抗原、针对所检测的抗体的与顺磁性粒子结合的抗体和与抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或其功能衍生物结合的化学发光性吖啶鎓化合物混合，形成固相配合物，(b)从液相中磁分离固相，(c)如果有的话，在所分离的固相中引发化学发光反应，和(d)分析所分离的固相中化学发光相的存在，指示样品中所述抗体的存在。现有技术方法特别适合于测量体液中特异性免疫球蛋白的浓度，例如选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及其小类的特异性免疫球蛋白。现有技术方法也适合于一类或一小类免疫球蛋白总含量的检测和定量，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM及其小类。在现有技术方法的一个优选实施方式中，固相配合物的形成分两步进行，即第一步将样品与生物素结合配体抗原、抗体或半抗原和与顺磁性粒子结合的抗体混合，形成第一固相配合物，第二步向第一固相配合物中加入化学发光性吖啶鎓化合物，形成第二固相配合物。不过，现有技术方法的实际应用揭示了这样一个事实，在该方法的某些应用中，会发生来自不同于所测量种类的其它类型免疫球蛋白和/或其它类型免疫活性血清组分的干扰而引起所得结果产生误差。V.Olivieri等发表在《免疫学方法杂志》157(1993)65-72上的“特异性IgE的捕捉试验”一文公开了变应性患者血清中特异性IgE的测量方法，该方法采用单克隆抗人IgE(涂在微量滴定板小孔上)和生物素基化变应原溶液。在单一温育中，IgE通过Fc片段与固相结合，生物素基化变应原与它们的特异性IgE Fab区反应。第二步，加入抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶缀合物，以揭示固定在固相上的生物素的量。该文研究了来自高水平非特异性IgE和变应原-特异性IgG的干扰。发现该测定不受变应原-特异性IgG的影响。WO 98/16829公开了这样一种测定法，其中将抗免疫球蛋白与微量滴定板小孔偶联，然后洗涤。然后向孔中加入测试血清，以捕捉试样中所有的目标免疫球蛋白。然后，吸出生物流体样品，洗涤微量滴定板。然后使微量滴定板上所捕捉的抗体与生物素基化抗原接触，洗涤滴定板，加入抗生蛋白链菌素/碱性磷酸酶缀合物，再次洗涤滴定板。现有技术测定法可用于监测标准抗生素疗法对幽门螺杆菌感染的治疗效果。专利技术概述本专利技术的第一个目的是提供这样一种类型的方法，其中将目标抗体与指向Fc的抗体(该抗体与固体粒子偶联)和指向Fab的配体配合，该方法不会有上述解释的受到来自试样其它组分的干扰这个缺陷。借助本专利技术的方法达到第一个目的，其第一方面是由权利要求1-6所限定的，专利技术的新的必要特征是在加入配体之前另外按顺序进行中间体固相配合物的分离和洗涤，该配合物由带有反应物抗体的粒子和样品抗体组成。本专利技术方法基于如下认识通过另外引入这样一个分离和洗涤顺序，可能产生干扰的液体样品中的过量原料以及可能产生干扰的过量组分(ⅱ)可以从方法中除去，于是消除所述因素在随后步骤中产生干扰的危险。已经惊人地发现，另外的分离和洗涤顺序已经基本上减少了、在某些情况下消除了不同类型免疫活性血清组分之间产生干扰的技术问题。减少干扰涉及许多技术优点。特别是可以更精确地测量有疑难的血清，它们具有难以预测和不可预测比例的抗体混合物。此外，可以避免抗体的假阳性鉴别。减少干扰还可在比现有技术方法更为广泛的抗体浓度范围内进行精确地测量。本专利技术的第二个目的是提供能够评价和/或预测特异性变应性疫苗接种(SAV)的效果。借助本专利技术的第二方面达到第二个目的，它是由权利要求7-12所限定的。按照此方面，利用不同类型免疫活性血清组分(例如抗体)之间的干扰的水平、性质和暂时发展作为参数，用于评价特异性变应性疫苗接种治疗效果。于是，已经惊人地发现，所述参数具有关于人免疫状态以及人对所选择的治疗方案的反应的重要信息。本专利技术的第三个目的是提供评价患者免疫状态的方法。借助本专利技术的第三方面达到第三个目的，它是由权利要求20-31所限定的。按照此方面，利用不同类型免疫活性血清组分(例如抗体)之间的干扰的水平、性质和暂时发展作为参数，用于评价患者免疫状态，特别是用于评价/预测变应性治疗、变应性疫苗接种治疗或特异性变应性疫苗接种治疗的效果。于是，已经惊人地发现，所述参数具有关于人免疫状态以及人对所选择的治疗方案的反应的重要信息。本专利技术的第四个目的是提供评价患者变应性治疗效果的方法。借助本专利技术的第四方面达到第四个目的，它是由权利要求32-35所限定的。该方面专利技术基于这样的认识借助子测定1、A和C(分别见权利要求20、21和29)所得测量、也就是在样品中干扰因素存在下所进行的测量特别可用于评价变应性治疗、变应性疫苗接种治疗和特异性变应性治疗(SAV)的效果。于是，借助该方法所得测量是在相当于体内条件的条件下得到的，因此在评价治疗效果时是更具生理学和临床相关性的测量。专利技术的第一方面第一方面专利技术的一个优选实施方式的特征在于在一步操作中分别加入步骤(r’)、(r)或(r”)的组分(ⅲ)和步骤(s’)、(s)或(s”)的组分(ⅳ)。第一方面专利技术的第一种备选实施方式的特征在于在进行步骤(s’)、(s)或(s”)之前分别洗涤步骤(r’)、(r)或(r”)中所形成的三组分固相配合物，以除去没有配位结合的化合物。专利技术的第二方面特异性变应性疫苗接种(SAV)以前称为特异性免疫疗法或脱敏作用，自本世纪初以来已经用于1型IgE介导的变应性疾病的治疗。通过SAV获得的一般好处是a)减少变应性症状和药品消耗，b)提高对眼、鼻和肺中变应原的耐受性，和c)减少皮肤反应性(早期和晚期反应)。通过SAV所获得的改善的基本机理是未知的，但是从近几十年所进行的大量SAV研究可以得出许多普遍特征1)IgE总量在治疗阶段中是不变的，2)变应原特异性IgE的量随剂量上升而瞬时增加，然后降回到最初(治疗前)水平，3)IgE的表位特异性和亲和性保持不变，4)变应原特异性IgG、特别是IgG4在SAV过程中迅速升高，5)明显地引发新的Th0/1应答，和6)Th2应答似乎不变。由SAV诱导的效果与特异性IgG起始之间没有相互关联。SAV诱导新的免疫应答，在治疗阶段中成熟(Th0/1 T-细胞被募集，变应原特异性IgX(X可以是A1、A2、G1、G2、G3、G4、M或D)被引发)。由于新抗体应答IgX的亲和性(或数量/亲和性)已经成熟，IgX可以与IgE有效地竞争变应原，抑制“正常的”基于Th2的变应原应答，后者是以受体结合IgE在肥大细胞和嗜碱细胞表面上的交联为特征的。于是，临床症状得以逐步减轻。本专利技术基于这样的假设，如果在有和没有竞争性化合物(IgX和/或任意其它干扰物)的存在下测量特异性IgE的量，个体患者免疫应答的竞争能力测量可以进行计算，该测量将与适当的效果参数相互关联。大多数现有技术“定量的”IgE测定法测量在没有竞争性化合物存在下的IgE。本专利技术描述在有和没有任意(血清来源的)竞争性物质的存在下的IgE测量。于是，由权利要求1-6所限定的方法(参照图2a-c)在没有竞争剂的存在下测量Ig本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测和／或量化液体样品中抗体的方法，包括下列步骤： （ｏ’）提供液相和两组分固相配合物的混合物，该配合物由（ｉ）样品的抗体和（ｉｉ）针对该样品抗体的反应物抗体组成，该反应物抗体是与固体粒子结合的， （ｐ’）从液相中分离两组分固相配合物， （ｑ’）洗涤所分离的两组分固相配合物，以除去没有与配合物结合的化合物， （ｒ’）向洗涤后的两组分固相配合物中加入（ｉｉｉ）抗原、抗体或半抗原形式的配体的溶液，该配体是可选被标记的，形成三组分固相配合物， （ｓ’）可选地向三组分固相配合物中加入（ｉｖ）标记化合物的溶液，形成四组分固相配合物， （ｔ’）从溶液中分离分别在步骤（ｒ’）或（ｓ’）中得到的三或四组分固相配合物， （ｕ’）洗涤所分离的多组分固相配合物，以除去没有与配合物结合的化合物， （ｖ’）进行洗涤后的经过标记的多组分配合物的检测／测量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：N约翰森，R莫克伯格，S波吉斯特兰德，TC贝克，HH伊普森，
申请(专利权)人：阿尔克阿贝洛有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]