检测抗P53抗体的测定方法技术

本发明专利技术提供一种检测能结合ｐ５３蛋白的抗体的方法，该方法使用固定有ｐ５３肽的、表面等离子体振子共振生物传感器。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测能与p53蛋白，特别是人的p53蛋白，结合的抗体的方法。背景野生型p53基因是一种编码细胞的野生型p53蛋白的肿瘤抑制基因。内源性野生型p53蛋白在多种癌细胞内，如乳腺癌细胞和肺癌细胞内，是缺乏的(或缺如或突变)，已经发现给缺乏内源性野生型p53蛋白的癌细胞施予野生型p53基因能通过抑制其肿瘤的表型用以治疗癌症。见美国专利5,532,220。在实行p53基因治疗中，极希望在曝露于外源p53基因之前及后监测患者的血清样品，以确定应此种曝露的免疫原性反应是否增高。这可通过利用在血清样品中筛选能够结合p53的抗体的试验来完成。而且，由于有些癌症患者对他们生成的突变p53产生抗体，很需要有一种诊断试验来测定血清样品中存在的能结合p53的抗体。在PCT专利出版物WO94/10306中Soussi等披露了一种试验方法，用生物素化的肽以酶联免疫吸附试验(ELISA)的形式检测患者血清样品中的p53抗体。然而，仍极期望提供一种新的、改进的检测p53抗体的试验方法。需要改进的主要方面如下首先，急需一种更适于检测低亲和力抗体的试验方法。采用ELISA方法在这方面有困难，因为ELISA需要多次的温育步骤及随后的洗涤循环，在此过程中低亲和力抗体会被洗掉。其次，需要一种比使用ELISA方式的麻烦程度低的方法。第三，需要显著地缩短分析时间，最好是每样品少于10分钟，以便能进行高流通量的分析。如上所述，ELISA需要多次的温育步骤及随后的洗涤循环，因此试验中所使用的材料不能再生用于其后样品的分析。专利技术概述本专利技术能满足前述的需要，提供一种测定能与p53蛋白结合的抗体的方法，包括A)将一种肽直接固定在生物传感器中的传感芯片的流动池上，该肽能特异性地与抗p53的抗体相结合，B)从待测患者获得血清样品并将此血清样品稀释在适当的缓冲液中，C)使稀释的血清样品与固定化的肽接触，以及D)用生物传感器测定抗体与固定化肽的结合。在本专利技术的方法中，优选使用多数的选择的免疫原性肽，每一种肽直接固定在各自分别的流动池上。优选地，第一种肽选自p53蛋白的氨基端区域，第2种肽选自p53蛋白的羧基端区域。更优选地，本专利技术使用以下4种肽中的一种或多种(或与之具有基本序列同一性的肽)a)包含序列1(C11-35，相当于人p53蛋白残基11-35；H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENVLSPL-酰胺)的一种肽，或与之具有基本序列同一性的一种肽；b)包含序列2(C40-65，相当于人p53蛋白残基40-65H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺)的一种肽，或具有基本序列同一性的一种肽；c)包含序列3(C346-370，相当于人p53蛋白残基346-370H-EALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰胺)的一种肽，或具有基本序列同一性的一种肽；以及d)包含序列4(C371-390，相当于人p53蛋白残基371-390H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺)的一种肽，或具有基本序列同一性的一种肽，(以上列举序列采用标准的单字母氨基酸符号；见，如，Lehninger，Principles of Biochemistry，Worth Publishers，Inc第6版，1998，p.96)。附图简述附图说明图1以响应单位对稀释倍数作图，表示上述4种肽对正常人血清中抗体的相对灵敏度。图2以响应单位对稀释倍数作图，表示上述4种肽对正常猪血清中抗体的相对灵敏度。图3A及3B以图形描述正常人血清样品中抗体(对上述4种肽)的结合。图中缩写NHS＝混合的正常人血清。POS＝羊多克隆抗体以1∶200稀释于混合正常人血清中。对于肽C11-35，均值为41.1，标准差(SD)为29.8；对于肽C40-65，均值为30.6，标准差为27.0；对于肽C346-370，均值为38.9；标准差为30.9；对于肽C371-390，均值为38.0，标准差为18.7。图4A及4B以图形描述正常猪血清样品中抗体(对上述4种肽)的结合。图中，NPS＝混合正常猪血清，1∶40稀释，POS＝羊多克隆抗体以1∶200稀释于混合正常猪血清中。对于肽C11-35，均值为50.9，标准差17.7；对于肽C40-65，均值为52.9，标准差15.6；对于肽C346-370，均值为35.0，标准差16.6，对于肽C371-390，均值为38.8，标准差14.8。专利技术详述此处引用的一切参考文献均全文引入以供参考。本专利技术方法中，选用的免疫原性肽直接固定在生物传感器的传感芯片的流动池上。以往的试验，例如Soussi等的试验所采用的ELISA方式利用固定化的链亲和素去捕获生物素化的肽，因此，肽的固定是间接的。此处例子(下文详述)中描述的优选实施方案中，直接固定技术包括使用胺及/或巯基化学法直接固定N-标记的半胱氨酸肽。专利技术人发现直接固定法具有数种关键性的优势，包括对低亲和力抗体的检测要好得多(得到显著夺更加精确的分析)。此外，本专利技术显著地缩短分析时间，得以进行高流通量的分析。与以往的测定不同，本专利技术的测定法具有直接固定的特征，藉以下事实得以实现高流通量，即在分析了一个样品后，在此测定中所用过的材料能迅速再生用于以后样品的分析。本专利技术的直接固定技术允许用试剂，如HCl-SDS溶液(优选25mM HCl-0.25％SDS)进行快速而容易的洗涤。本专利技术还提供一种测定方法只需要少量的血清，例如少于5μl，来进行一次分析。过去的测定采用ELISA型式的微量滴定板可能需要病人更多的血清，例如当需要鉴定病人生成的抗体特性时。在这方面，专利技术人也已发现他们的新方法能对测出的抗体进行同种型鉴定而不需要另外的样品。(Soussi等的测定方法为确定同种型需要多次使用样品)。本专利技术方法中采用的优选肽选自以下a)肽C11-35，相当于人p53蛋白残基11-35；H-CEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPL-酰胺；b)肽C40-65，相当于人p53蛋白残基40-65H-CMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPR-酰胺；c)肽C346-370，相当于人p53蛋白残基346-370H-CEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLK-酰安；以及d)肽C371-390，相当于人p53蛋白残基371-390H-CSKKGQSTSRHKKLMFKTEGP-酰胺，与上述肽具有基本序列同一性的肽也能在优选实施方案中使用。此外，“基本序列同一性”的含义是当两种肽序列，进行最优方式对比时，譬如藉使用“缺失间隔加权”的GAP或BESTFIT程序，具有至少80％序列同一性，优选地至少90％序列同一性，更优选地至少95％序列同一性或更高。优选地，不同一的残基位置的差异是保守性氨基酸替换。例如，具有相似化学性质如电荷或极性的氨基酸的替换不大可能影响蛋白质的性质。这类例子包括谷氨酰胺替代天冬酰胺或谷氨酸替代天冬氨酸。本专利技术的优选实施方案中多种被选择的免疫原性肽能得到直接固定，每种固定在各自分隔的流动池上。例如，第一个肽可选自p53蛋白的氨基端区，第二个肽可选自p53蛋白的羧基端区。在一个更为具体的例子中，第一个肽包含序列1(H-CEPPLSQETFSDLWKLLP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测能与ｐ５３蛋白结合的抗体的方法，包括：Ａ）将肽直接固定在生物传感器的传感芯片的流动池上，所述肽能与抗ｐ５３抗体特异结合，Ｂ）从待查患者取得血清样品，并将血清样品稀释于适宜的缓冲液中，Ｃ）使稀释的血清样品与固定化肽接触，以 及Ｄ）用生物传感器测量抗体与固定化肽的结合。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DT梅泰奇，SJ斯旺森，
申请(专利权)人：先灵公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]