一种猪瘟活疫苗的生产方法技术

本发明专利技术涉及一种猪瘟活疫苗的生产方法。本发明专利技术包括以下技术步骤：（１）猪瘟兔化弱毒株的克隆与鉴定；（２）克隆株种毒的繁殖；（３）生产用细胞的繁殖；（４）生产用病毒液的繁殖；（５）配苗、分装和冻干。本发明专利技术具有生产工艺简单、稳定，病毒免疫原性和遗传稳定性好，外源病毒污染风险小，检验方便，生产成本低等特点。利用本发明专利技术生产的猪瘟活疫苗遗传稳定性好、纯净性高、免疫原性强。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于兽用生物制品
技术背景猪瘟(ClassicalSwine Fever, CSF)是由猪癌病毒(Classical Swine Fever Virus， CSFV)引起的一种高度接触性、致死性的猪传染病，在世界上很多国家和地区均有发 生，给畜牧业生产带来了严重的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将猪瘟列为法定通 报性疫病，我国将其划为一类动物传染病。目前世界上主要有3种效果较好的猪瘟活疫苗，即日本的GPE株、法国的 Thiverval株和中国的兔化弱毒株(C株)，其中兔化弱毒株应用最为广范并为世界上许多 国家猪瘟的控制和消灭做出了重要贡献。目前，我国也实行强制免疫猪瘟弱毒活疫苗作 为控制猪瘟的主要手段。虽然三种疫苗均能有效用于猪瘟防制，但也都存在着一定不足。其中GPE株、 Thiverval株是用猪源传代细胞系生产的，其存在已知或未知外源病毒污染的风险较大， 一旦控制不好，很容易导致某种已有的或新发现的传染病大面积流行。其中兔化弱毒活 疫苗目前有两种生产工艺，第一种工艺是用兔体生产，取接种家兔的组织或淋巴结或脾 脏制苗，该工艺可以有效避免外源病毒污染，同时保证了病毒的遗传稳定性，病毒毒力 不返强，但需要使用大量家兔，质量控制难度较高且生产成本较高；第二种工艺是应用 牛、羊原代细胞或猪传代细胞生产，该工艺避免大量使用实验动物，但存在外源病毒污 染的风险(因为牛、羊原代细胞或猪传代细胞对很多已知或未知的外源病毒易感)并且病 毒遗传稳定性稍差，病毒有独立返强的风险。另外，猪瘟兔化弱毒是经过兔体连续传代 驯化而成的，种毒并未经过克隆纯化，因次不同批次的种毒对同一批家兔或同一批次的 种毒对不同批次的家兔感染性和免疫原性往往存在一定差异。由此可见，亟需一种新的 猪瘟活疫苗生产工艺来克服已有的几种疫苗存在的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服猪瘟活疫苗现有生产工艺的不足之处，提供一种用克隆化 猪瘟兔化弱毒种毒接种兔源细胞或常用细胞进行细胞培养，收获病毒液生产猪瘟活疫苗 的方法。该方法具有生产工艺简单、易于质量控制、外源病毒污染风险小、生产成本低 等特点。利用本专利技术生产的猪瘟活疫苗遗传稳定性好、纯净性高、病毒效价高、免疫原 性强。本专利技术的技术方案是用猪瘟兔化弱毒株病毒经过病毒终点稀释技术获得的一 株获得高度适应兔源细胞或常用细胞、基因型单一并且能稳定遗传的纯系猪瘟兔化弱毒 克隆株CSFVCC-1，该病毒株已于2010年7月沈日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.4058，将CSFV CC_1通过兔源细胞和/或常用 细胞进行细胞培养，收获病毒液；将收获的病毒液加入常用的冻干保护剂，充分混合后分装后经冷冻真空干燥而制成冻干活疫苗，每头份含毒量不低于6000TCID5(i或400RID。本专利技术的详细描述1猪瘟兔化弱毒的克隆与鉴定1.1猪瘟兔化弱毒的克隆用终点稀释法进行。(1)在M孔细胞板中置入细胞培养载波片，并接种适量的兔源细胞或常用细 胞，在CO2培养箱37°C将细胞培养至单层；(2)将猪瘟病毒兔化弱毒株种毒(中国兽医药品监察所保藏和供应，CVCC AV1412)稀释至0.1TCID50/0.1ml,以0.1ml/孔剂量接种(1)细胞板；(3)置CO2培养箱37°C培养3d，取出各孔培养液及细胞载波片；(4)将细胞载波片固定，进行猪瘟荧光抗体染色；(5)将荧光染色阳性孔的培养液再进行稀释接种置入细胞培养载波片的M孔 板，进行再次克隆；(6)反复进行3 5次，即获得克隆化猪瘟兔化弱毒种毒，命名为CSFV CC-I (本毒株已于2010年7月沈日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保减号为CGMCCNo.4058)；1.2克隆株的鉴定经鉴定，克隆株CSFV CC-I具有以下特性(1)对细胞的适应性将CSFV CC-I接种兔源细胞进行细胞培养并取样 测定毒价，经转瓶培养最高毒价M06°TCID5(l/0.1ml，经微载体或悬浮培养最高毒价 >1068TCID50/0.1ml ；将CSFV CC-1接种常用细胞进行细胞培养并取样测定毒价，经转瓶 培养最高毒价M05°TCID5(l/0.1ml，经微载体或悬浮培养最高毒价M06°TCID5(l/0.1ml ；(2)遗传稳定性将CSFV CC-I经兔源细胞连续传代并进行基因序列测定，第 30代与第1代克隆化种毒核苷酸同源性为99.9%，氨基酸同源性为100%;将CSFV CC-I 经常用细胞连续传代并进行基因序列测定，第30代与第1代克隆化种毒核苷酸同源性为 99.5%,氨基酸同源性为99.9% ；(3)生物学特性将CSFV CC-I进行猪瘟抗体抑制试验，猪瘟抗体能特异性抑 制该种毒的荧光产生；将CSFV CC-I以15TCID5(I(或1RID) /只的剂量静脉接种健康家 兔，结果95%产生定型热或轻型热；(4)免疫原性将CSFV CC-I以150 RID/只的免疫剂量肌肉接种非免疫健康 猪，抗体平均最高滴度达到1 128，平均持续时间为400d;免疫后2周攻Iml猪瘟石门 血毒(IO5MLD/Iml)，100%保护，最高体温《41 %且持续不超过3d ；(5)安全性将 CSFV CC-I (>105'°TCID50/0.1ml) IOml 注射家兔、IOOml 注射 猪、5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠均不引起死亡；2疫苗的制备2.1种毒的繁殖将CSFV CC-I种子批种毒接种生长良好的兔源细胞或常用细胞的种子批细胞，培养3 4天后收毒，作为生产用种毒；种毒检验按《中华人民共和国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五年版三部.中国农业出版社，2006，本专利技术以下简称《中国兽药典》)规 定的方法进行检验，应符合无菌检验和外源病毒检验标准规定；2.2生产用细胞的传代与培养种子批细胞经消化、分散后，进行细胞培养，形成单层或生长至合适密度时， 用于继续传代或接种病毒；细胞检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应符合生产、检验用细胞 标准规定；2.3生产用病毒液的繁殖将生产种毒接种生长良好的生产用细胞，进行细胞培养，3 4天后收获病毒 液，-15°C以下保存；生产用病毒液检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应符合无菌检验 和外源病毒检验标准规定；并且每ml含毒量不少于60000 (或4000RID)；2.4配苗、分装和冻干将检验合格的病毒液，加入适当稳定剂和抗菌素，混勻，定量分装，每头份含 毒量不低于6000TCID5(1 (或400RID)，冷冻真空干燥即成；成品检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应符合无菌检验和外源病 毒检验标准规定；用10头份注射敏感子猪，应不引起明显症状；每头份含毒量不少于 6000TCID50 (或 400RID)。本专利技术涉及的一些专用词的界定1.兔源细胞是指兔原代细胞或传代细胞；2.常用细胞是指牛睾丸原代细胞、羊睾丸原代细胞、羊肾原代细胞、牛BT细 胞系、猪SK-6细胞系、猪ST细胞系、猪PK-15细胞系、猪IBRS-2细胞系；3.细胞培养是指细胞在适宜的温度和密度下，经转瓶培养或细胞微载体培养 或细胞悬浮培养。本专利技术的积本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪瘟活疫苗的生产方法，其特征是用猪瘟兔化弱毒株病毒经过病毒终点稀释技术获得的一株猪瘟兔化弱毒克隆株ＣＳＦＶ　ＣＣ－１，该病毒株已于２０１０年７月２６日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．４０５８，将ＣＳＦＶ　ＣＣ－１通过兔源细胞和／或常用细胞进行细胞培养，收获病毒液；将收获的病毒液加入常用的冻干保护剂，充分混合后分装后经冷冻真空干燥而制成冻干活疫苗，每头份含毒量不低于６０００ＴＣＩＤ↓［５０］或４００ＲＩＤ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴志红，王在时，关孚时，蒋卉，李翠，赵耘，秦玉明，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]