一种采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特点是将传代贴壁细胞MPK细胞接种到装有微载体的生物反应器中，细胞生长所需的培养基灌注到生物反应器，MPK细胞在反应器内快速增殖，当细胞密度稳定后接种猪瘟病毒，并开始连续收获猪瘟病毒培养液，得到的病毒培养液经澄清、浓缩，在加入稳定剂和缓冲液配苗后，真空冷冻干燥制成猪瘟活疫苗。本发明专利技术采用微载体高密度细胞培养技术，细胞密度在生物反应器内可达到8～16×106个/ml，病毒培养液的收获量比转瓶培养的提高了20～40倍，显著提高猪瘟活疫苗生产效率和产量，降低生产成本，减轻疫苗的副反应，增强疫苗生产的批次稳定性，得到更为安全有效的猪瘟活疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种 兽用生物制品，特别是涉及，属于兽用生物制品
技术介绍
目前国内生产猪痕活疫苗的方式主要有脾淋疫苗(动物组织法)、细胞疫苗。细胞疫苗又分为原代(牛睾丸细胞)和传代(猪睾丸细胞)两种细胞生产方式。脾淋疫苗的免疫保护力要好于细胞疫苗，但一只兔子仅能生产500头份效力不低于100 PD50的猪瘟疫苗。仅在中国，每年的猪瘟疫苗的市场容量不低于14亿头份，这相当于需要280万只兔子来制备这些疫苗，如此庞大的数量，是不可能实现的。所以，细胞疫苗是未来生产猪瘟活疫苗的发展方向。目前，前面提到的两种细胞均可用于猪瘟活疫苗的生产。当采用牛睾丸原代细胞生产时，存在一种外源病毒BVDV的感染风险，一旦牛睾丸原代细胞感染BVDV，将极大影响猪瘟活疫苗的质量；另外，牛睾丸原代细胞的制备来源很受限制，它需要从活体组织上获取。由此，传代细胞更适合猪瘟活疫苗的生产。近年来，利用猪睾丸传代细胞生产猪瘟活疫苗已在国内得到了广泛的应用，其生产用细胞主要采用转瓶培养，当大规模生产时，需要大量的人力和物力，生产效率低；细胞在转瓶内生长和产毒时，营养供应、环境pH、培养基内含氧情况都不能及时调整，转瓶内的细胞密度只有0.5 I X IO6个/ml，这些都会影响疫苗的质量和产量；由于每瓶内细胞状态不尽相同，进而导致产品的均一性很差，从而造成疫苗产品的质量水平有较大的波动。这些都不利于优质、高效地生产猪瘟疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，为了能够优质、高效地生产猪瘟疫苗，而提供一种创新的猪瘟活疫苗生产方式，即采用微载体高密度细胞培养技术，通过生物反应器高效生产猪瘟活疫苗的方法。本专利技术选用了一种完全不同的传代细胞系，小型猪肾细胞(MPK)。经驯化，猪瘟病毒可以很好地在该细胞系内快速增殖；由于该细胞系为猪源细胞，所以可降低疫苗注射后异源蛋白引起的不良反应；同时该细胞系生长时对营养条件要求不十分苛刻，因而适合大规模、高密度培养。本专利技术由于米用微载体高密度细胞培养技术，可使细胞密度达到8 16X IO6个/ml，由此得到的病毒培养液的收获量与转瓶培养相比可提高20 40倍，因此显著提高了猪瘟活疫苗的生产效率和产量，同时也降低了生产成本，减轻了疫苗的副反应，还增强了疫苗生产的批次稳定性，得到了更为安全和有效的猪瘟活疫苗。为了达到本专利技术的目的，本专利技术给出的技术解决方案是:这种采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特点是将传代贴壁细胞MPK细胞接种到装有微载体的生物反应器中，细胞生长所需的营养培养基经连续灌注的方式加入生物反应器，MPK细胞在反应器内快速增殖，当细胞密度稳定后接种猪瘟病毒，并开始连续收获猪瘟病毒培养液，由此得到的病毒培养液经澄清、浓缩，在加入稳定剂和缓冲液配苗后，真空冷冻干燥制成猪瘟活疫苗，具体步骤为:(I)将MPK细胞在转瓶内扩增；(2)经转瓶培养得到足量的细胞后，接种到装有微载体的生物反应器中开始高密度细胞增殖培养；(3)当反应器内细胞密度增长稳定后，接种猪瘟病毒；(4)在接种病毒后第三天，开始连续收获反应器内的病毒培养液，收获期维持25 35天；(5)收集到的病毒培养液，经澄清、浓缩，加入稳定保护剂和PH缓冲液配制成疫苗原液，再将原液分 装，经冷冻干燥得到猪瘟活疫苗成品。本专利技术提及猪瘟病毒的细胞感染毒株为来源于中国兽医药品监察所的猪瘟兔化弱毒株，属于现有技术。本专利技术提及的MPK细胞为Minipig Kidney Cell，是一种传代贴壁细胞系。经对微载体的贴壁适应性驯化，得到适应在微载体上贴壁生长的特异性MPK细胞。为更好的实现本专利技术的目的，使用的微载体为NBS公司的Fibra Disk、GE公司的Cytodex I和Cytodex 3中的一种；使用的生物反应器为NBS公司带有CELL LIFT IMPELLER和DECANTER的细胞培养罐，或者是NBS公司带有BASKET的细胞培养罐中的一种。为更好的实现本专利技术的目的，所述步骤(I)、(2)中使用的细胞生长培养基是经过优化的，适合MPK细胞生长的培养基。每升液体培养基含有5 8克的高糖DMEM，3.5 5.5克的M199，1.5 3克的NaHCO3, 50 120毫升的牛血清；培养基的pH为7.2 7.4。为更好的实现本专利技术的目的，MPK细胞在生物反应器内适宜生长温度为36.5 37.50C，适宜培养pH为7.0 7.5，适宜溶氧值为25% 85%，适宜搅拌速度为30 120rpm ο为更好的实现本专利技术的目的，MPK细胞在反应器内生长时，培养基的灌注速度根据培养基中糖类的代谢消耗变化和乳酸的代谢累积变化，阶段性调整灌注速度，每天的培养基消耗量为0.5 5个生物反应器培养体积。为更好的实现本专利技术的目的，所述步骤(3)中，细胞经高密度培养后，密度可达到8 16X IO6 个/ml。为更好的实现本专利技术的目的，所述步骤(4)中，细胞培养基更换为经优化的维持培养基，每升液体培养基含有5 8克的高糖DMEM，3.5 5.5克的M199，1.5 3克的NaHCO3, 50 120毫升的牛血清；培养基的pH为7.2 7.4，该培养基可延长病毒收获期。为更好的实现本专利技术的目的，所述步骤(5)中，最后得到的猪瘟活疫苗可在2 8°C条件下保存12月，疫苗的生物活性不损失。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是:提供了，通过此种方法可得到高产、优质的疫苗。其优势特点集中为:(O细胞密度是转瓶生产的10 20倍；(2)收获的病毒量是转瓶培养的20 40倍；(3)制得的疫苗的免疫活性可在2 8°C条件下保存12月；(4)采用生物反应器和微载体培养技术极大降低了生产成本，提高了生产效率；(5)疫苗成品的均一性和稳定性得到了大幅提高。利用本专利技术可得到免疫保护性良好的猪瘟活疫苗。附图说明图1:Fibra Disk微载体培养病毒滴度和培养基残糖量曲线图。图2:cytodex I微载体培养细胞生长曲线图。图3:cytodex I微载体培养病毒滴度和培养基残糖量曲线图。图4:cytodex 3微载体培养细胞生长曲线图。图5:cytodex 3微载体培养病毒滴度和培养基残糖量曲线图。具体实施例方式为使本专利技术的优点和 特点更加容易理解，下面通过三种微载体高密度细胞培养方式，结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。但这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围。下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1。(I)选择微载体:NBS公司的Fibra Disk。(2)选择反应器:NBS公司的带有BASKET的5升细胞培养罐。(3)本实施例中选用小型猪肾细胞(MPK)，MPK细胞按1: 2 8的比例在细胞培养瓶或转瓶中传代培养，通常每个代次细胞的生长时间为48 72h。当细胞汇合率超过80%后，向生物反应器中接种细胞。(4)接种生物反应器的细胞，与经优选的微载体装量为100克，完全贴壁后，细胞密度达到1.5X IO6个细胞/ml，开始连续灌注培养基，调整培养过程控制条件:生长温度36.5 37.5°C、搅拌速度60 120r本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于将传代贴壁细胞MPK细胞接种到装有微载体的生物反应器中，细胞生长所需的营养培养基经连续灌注的方式加入生物反应器，MPK细胞在反应器内快速增殖，当细胞密度稳定后接种猪瘟病毒，并开始连续收获猪瘟病毒培养液，由此得到的病毒培养液经澄清、浓缩，在加入稳定剂和缓冲液配苗后，真空冷冻干燥制成猪瘟活疫苗，具体步骤为：（1）将MPK细胞在转瓶内扩增；（2）经转瓶培养得到足量的细胞后，接种到装有微载体的生物反应器中开始高密度细胞增殖培养；（3）当反应器内细胞密度增长稳定后，接种猪瘟病毒；（4）在接种病毒后第三天，开始连续收获反应器内的病毒培养液，收获期维持25～35天；（5）收集到的病毒培养液，经澄清、浓缩，加入稳定保护剂和pH缓冲液配制成疫苗原液，再将原液分装，经冷冻干燥得到猪瘟活疫苗成品。
【技术特征摘要】
1.一种采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于将传代贴壁细胞MPK细胞接种到装有微载体的生物反应器中，细胞生长所需的营养培养基经连续灌注的方式加入生物反应器，MPK细胞在反应器内快速增殖，当细胞密度稳定后接种猪瘟病毒，并开始连续收获猪瘟病毒培养液，由此得到的病毒培养液经澄清、浓缩，在加入稳定剂和缓冲液配苗后，真空冷冻干燥制成猪瘟活疫苗，具体步骤为: (1)将MPK细胞在转瓶内扩增； (2)经转瓶培养得到足量的细胞后，接种到装有微载体的生物反应器中开始高密度细胞增殖培养； (3)当反应器内细胞密度增长稳定后，接种猪瘟病毒； (4)在接种病毒后第三天，开始连续收获反应器内的病毒培养液，收获期维持25 35天; (5)收集到的病毒培养液，经澄清、浓缩，加入稳定保护剂和pH缓冲液配制成疫苗原液，再将原液分装，经冷冻干燥得到猪瘟活疫苗成品。2.根据权利要求1所述的采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于使用的微载体为NBS公司 的Fibra Disk、GE公司的Cytodex I和Cytodex 3中的一种。3.根据权利要求1所述的采用微载体高密度细胞培养技术生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于使用的生物反应器为NBS公司带有CELL LIFT IMPELLER和DECANTER的细胞培养罐，或者是NBS公司带有BASKET的细胞培养罐中的一种。4.根据权利要求1所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓锋，高军，侯剑英，
申请(专利权)人：辽宁成大动物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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