一种猪瘟抗体检测系统及其制备方法技术方案

本发明专利技术提供了一种猪瘟抗体检测系统及其制备方法，所述检测系统的包被原含猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白。其中所述猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白均为真核表达的重组蛋白，保证了正确的空间构象和翻译后修饰过程，使抗原尽可能有效地与血清中抗体结合，提高了检测的特异性、灵敏度和重复性。该发明专利技术可应用于猪瘟预防控制中猪瘟病毒抗体的诊断及猪瘟疫苗的免疫评价。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和家畜疫病诊断领域，具体涉及一种猪瘟抗体检测系统及其制备方法。
技术介绍
猪瘟是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种高度接触性病毒传染病，传播快、流行广、发病率和死亡率高，对我国养猪业危害极大。根据临床症状和病程长短可将猪瘟分为急性型、慢性型、温和型。病猪和带毒母猪是猪瘟病毒的主要传染源。世界动物卫生组织将其列为A类疾病，中国《动物防疫法》将其列为一类疫病。猪瘟病毒属黄病毒科瘟病毒属，为单股正链RNA病毒，基因组大小约为12.3Kb，含有一个大的开放阅读框(ORF)，编码一个多聚蛋白，此多聚蛋白经病毒和宿主细胞的酶作用，形成4个成熟的结构蛋白(C、Erns、E1、E2)和至少7个非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)因为其操作简便，快速敏感的优点，广泛应用于市场上的猪瘟抗体监测方法。目前，市场上的猪瘟抗体诊断ELISA试剂盒大多数是检测猪血清中的E2蛋白抗体，而Erns蛋白作为包被原，仅用于鉴别诊断亚单位疫苗免疫后疫苗产生的抗体和野毒感染产生的抗体，且特异性和灵敏度均不理想。此类E2蛋白抗体检测ELISA试剂盒针对猪瘟大规模的群体诊断中，能够发挥有效的作用。但是对于一些早期感染或者猪瘟抗体水平低下的临床样本，单纯检测E2蛋白抗体，有出现假阴性的可能。因此，建立一种准确可靠的新型ELISA检测手段，用来弥补现有技术中单纯检测E2蛋白抗体的不足，对疾病的预防和控制有重要的意义。
技术实现思路
为了解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种猪瘟抗体检测ELISA试剂盒，以及该试剂盒的制备与使用方法。本专利技术的第一方面是一种猪瘟抗体检测系统，所述系统包被抗原为猪瘟病毒E2蛋白、Erns蛋白。术语“猪瘟病毒E2蛋白”位于病毒囊膜表面，由373个氨基酸组成，是猪瘟病毒主要保护性抗原，是抗猪瘟病毒感染的主要保护性抗原(李淼，王宇飞，王煜等.表达猪瘟病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析.生物化学与生物物理进展,2009,36(7):916-922)。术语“猪瘟病毒Erns蛋白”为病毒的囊膜糖蛋白，由227个氨基酸组成，无跨膜区(高华峰，李富祥，张念祖等.猪瘟病毒Erns基因的克隆及原核表达.动物医学进展,2007,28(2):22-24)。作为本专利技术的一种优选实施方式，在本专利技术的猪瘟抗体检测系统中，所述猪瘟病毒E2蛋白为实质上编码序列SEQIDNo.2的蛋白，所述Erns蛋白为实质上编码序列SEQIDNo.4编码的蛋白。术语“实质上编码”意指通过添加、删除、替换一个或多个氨基酸后仍然保持原有蛋白相同或相近功能。作为本专利技术的一种优选实施方式，在本专利技术的猪瘟抗体检测系统中，所述猪瘟病毒E2蛋白含量为100-400ng，Erns蛋白含量为25-100ng。作为本专利技术的一种最优选实施方式，在本专利技术的猪瘟抗体检测系统中，所述猪瘟病毒E2蛋白含量为200ng，Erns蛋白含量为50ng。作为本专利技术的一种优选实施方式，在本专利技术的猪瘟抗体检测系统中，所述猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白为真核表达体系表达的重组蛋白。作为本专利技术的一种最优选实施方式，在本专利技术的猪瘟抗体检测系统中，所述猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白为重组杆状病毒表达体系表达的重组蛋白。作为本专利技术的一种优选实施方式，在本专利技术的猪瘟抗体检测系统中，所述的检测系统包括ELISA检测试剂盒、试纸。作为本专利技术的一种优选实施方式，在本专利技术的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒中，试剂盒包括包被所述猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白的酶标板、样品稀释液、洗涤液、封闭液、带标记的二抗、显色液、显色液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照。作为本专利技术的一种优选实施方式，在本专利技术的猪瘟抗体ELISA检测试剂盒中，所述样品稀释液为含有0.05％V/VTween-20和10％V/V脱脂奶的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为含有0.05％V/VTween-20的磷酸盐缓冲液；所述封闭液为1％W/VBSA的磷酸盐缓冲液、5％W/V脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液、1.5％V/V明胶的磷酸盐缓冲液或5％V/V犊牛血清FCS的磷酸盐缓冲液中的任一种；所述显色液包括显色液A和显色液B液，所述显色液A液含TMB20mg、无水乙醇10ml，并用ddH2O定容至100ml；所述显色液B含柠檬酸2.1g、无水Na2HPO42.82g、0.75％W/V的过氧化氢尿素0.64ml，并用ddH2O定容至100ml；所述终止液为2M的H2SO4。术语“磷酸盐缓冲液”是指含有磷酸或其盐并被调至理想pH值的溶液，是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液。一般地，磷酸盐缓冲液是从磷酸或磷酸盐(包括但不限于钠和钾盐)制备的。本领域已经知道一些磷酸盐，例如磷酸二氢钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二钾、磷酸钠和磷酸钾。已经知道磷酸盐是以盐的水合物形式存在的。由于缓冲液的二级解离作用，缓冲的pH值范围很宽，例如约4-10的范围，优选约5-9的范围，更有选约6-8的范围，最优选约7.4。进一步优选地，所述磷酸盐缓冲液为含氯化钠和氯化钾的磷酸盐缓冲液。本专利技术的另一方面是一种所述猪瘟抗体检测系统的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)克隆表达所述猪瘟病毒抗原性蛋白E2蛋白、Erns蛋白，使用所述E2蛋白和Erns蛋白包被酶标板；(2)制备或配制样品稀释液、洗涤液、封闭液、HRP标记的兔抗猪IgG、显色液A液、显色液B液、终止液、阳性猪血清对照以及阴性猪血清对照；以及(3)将步骤(1)与(2)所制备的各成分组装成试剂盒。作为本专利技术的一种优选实施方式，在本专利技术的猪瘟抗体检测系统的制备方法中，所述步骤(1)中克隆表达E2蛋白为实质上编码序列SEQIDNo.2的蛋白，所述Erns蛋白为实质上编码序列SEQIDNo.4编码的蛋白；所述E2蛋白含量为100-400ng/孔，Erns蛋白含量为25-100ng/孔；优选地，所述猪瘟病毒E2蛋白含量为200ng/孔，Erns蛋白含量为50ng/孔。作为本专利技术的一种优选实施方式，在本专利技术的猪瘟抗体检测系统的制备方法中，所述步骤(1)使用真核表达体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪瘟抗体检测系统，其特征在于，所述检测系统包被抗原为猪瘟病毒E2蛋白、Erns蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟抗体检测系统，其特征在于，所述检测系统包被抗原
为猪瘟病毒E2蛋白、Erns蛋白。
2.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述猪瘟病毒
E2蛋白为实质上编码序列SEQIDNo.2的蛋白，所述Erns蛋白为实
质上编码序列SEQIDNo.4编码的蛋白；所述猪瘟病毒E2蛋白含量
为100-400ng，Erns蛋白含量为25-100ng；优选地，所述猪瘟病毒E2
蛋白含量为200ng，Erns蛋白含量为50ng。
3.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述猪瘟病毒
E2蛋白和Erns蛋白为真核表达体系表达的重组蛋白；优选地，所述
真核表达体系为重组杆状病毒表达体系。
4.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述的检测系
统包括ELISA检测试剂盒、试纸。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒包括
包被所述猪瘟病毒E2蛋白和Erns蛋白的酶标板、样品稀释液、洗涤液、
封闭液、带标记的二抗、显色液、显色液、终止液、阳性猪血清对照以
及阴性猪血清对照。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀
释液为含有0.05％V/VTween-20和10％V/V脱脂奶的磷酸盐缓冲液；
所述洗涤液为含有0.05％V/VTween-20的磷酸盐缓冲液；
所述封闭液为1％W/VBSA的磷酸盐缓冲液、5％W/V脱脂奶粉的
磷酸盐缓冲液、1.5％V/V明胶的磷酸盐缓冲液或5％V/V犊牛血清FCS
的磷酸盐缓冲液中的任一种；
所述显色液包括显色液A和显色液B液，所述显色液A液含TMB
20mg、无水乙醇10ml，并用ddH2O定容至100ml；所述显色液B含
柠檬酸2.1g、无水Na2HPO42.82g、0.75％W/V的过氧化氢尿素0.64ml，
并用ddH2O定容至100ml；
所述终止液为2M的H2SO4。
7.一种如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，杨凡力，
申请(专利权)人：洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41