一种降钙素原(PCT)测试试剂盒及其测试方法技术

本发明专利技术公开了一种降钙素原(PCT)的测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液，稀释液及发光底物组成，本发明专利技术还公开了该试剂盒的制备方法。本发明专利技术试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有酶联免疫的技术相比，本发明专利技术具有更高的特异性、灵敏度、获得检测结果的时间短、操作方式简便、检测结果准确可靠，大大降低了产品成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中降钙素原含量的试剂盒及其测试方法。
技术介绍
降钙素原(procalcitionin，检测PCT)是一种由116个氨基酸组成、分子量为13kDa的糖蛋白，是血清降钙素(CT)的前体物，在人体内半衰期约为20-24小时，稳定性好。正常条件下，PCT在甲状腺C细胞中生成并裂解成降钙素，人血清PCT含量极低，约2.5pg/ml。当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，PCT在血浆中的水平升高。自身免疫、过敏和病毒感染时PCT不会升高。局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症不会导致PCT升高。PCT作为一种新的、具有创新意义的严重细菌感染等疾病的实验指标，PCT提高了临床诊断的准确性，为重症监护、放化疗、服用免疫抑制剂或器官移植等患者合并发热时提供了及其重要的诊断、进一步的检查和治疗的临床依据，PCT可广泛应用于ICU病房、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科、介入诊断和治疗实验室等。中国专利200710073309.3公开了一种降钙素原测试试剂盒及其测试方法，试剂盒包含的试剂有：分离试剂、发光标记物、荧光素标记物以及采用纳米免疫磁性微珠作为分离试剂、采用抗PCT单克隆抗体标记异鲁米诺衍生物作为发光标记物的测试方法，该PCT试剂盒及其测试方法具有较高的灵敏度和特异性，但其出检测结果的时间较长，无形中增加了试剂盒的试剂成本。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果稳定可靠的降钙素原(PCT)的测试试剂盒及其测试方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种降钙素原(PCT)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液，稀释液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人PCT的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人PCT的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为132μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的PCT抗体，所述碱性磷酸酶标记的PCT抗体浓度为0.6μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量PCT抗原的牛血清白蛋白(第五组分)(简称BSAV)溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、0.1(S1)、1(S2)、5(S3)、50(S4)、100(S5)ng/ml，所述质控品的浓度为0.6,50ng/ml，所述校准品的浓度为1,50ng/ml；清洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；稀释液：含有牛血清白蛋白(第五组分)(BSAV)的溶液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。一种降钙素原(PCT)测试试剂盒，该试剂盒由下述体积分数组成：磁分离试剂4％-6％，试剂R14％-6％，试剂R24％-6％，标准品4％-6％，质控品1％-3％，校准品1％-3％，清洗浓缩液20％-30％，稀释液10％-20％，发光底物25％-40％。优选地，所述试剂盒由下述体积分数组成：磁分离试剂4％，试剂R14％，试剂R24％，标准品4％，质控品1％，校准品3％，清洗浓缩液30％，稀释液20％，发光底物30％。优选地，所述试剂盒由下述体积分数组成：磁分离试剂5.1％，试剂R15.1％，试剂R25.1％，标准品5.1％，质控品1.8％，校准品1.8％，清洗浓缩液25％，稀释液17％，发光底物34％。优选地，所述试剂盒由下述体积分数组成：磁分离试剂6％，试剂R16％，试剂R26％，标准品6％，质控品3％，校准品1％，清洗浓缩液20％，稀释液12％，发光底物40％。一种钙素原(PCT)测试试剂盒的制备方法，包括下述步骤：第一步：磁分离试剂的制备过程一、磁珠缓冲液配制操作规程：(1)称取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96gTween-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；(3)调节PH计测量其PH值；用4MHCl或4MNaOH调PH，测量其PH在7.95－8.05之间即符合要求；(4)称取BSAV(牛血清白蛋白(第五组分))3g倒入上述1L容器中；(5)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95－8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤即得；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；二、磁分离试剂的配制：(1)将1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ulDMSO中，即浓度为20mg/mL；取2mgPCT抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml；(2)计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直径在0.01-5.0μm之间，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分钟，其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris；(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的PCT磁分离试剂；(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1：1的比例混匀，即得本专利技术试剂盒中磁分离试剂；第二步：试剂R1的制备过程一、试剂R1稀释液配制操作规程：(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降钙素原测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液，稀释液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人PCT的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人PCT的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为132μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的PCT抗体，所述碱性磷酸酶标记的PCT抗体浓度为0.6μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量PCT抗原的牛血清白蛋白(第五组分)(简称BSA V)溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、0.1(S1)、1(S2)、5(S3)、50(S4)、100(S5)ng/ml，所述质控品的浓度为0.6,50ng/ml，所述校准品的浓度为1,50ng/ml；清洗浓缩液：含有Tween‑20和Proclin‑300的缓冲液；稀释液：含有牛血清白蛋白(第五组分)(简称BSA V)的溶液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。

【技术特征摘要】
1.一种降钙素原测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，
校准品，清洗浓缩液，稀释液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人PCT
的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人PCT的单克隆抗体的纳米磁性微球
的浓度为132μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的PCT抗体，所述碱性磷酸酶标记的
PCT抗体浓度为0.6μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品
和校准品：含有一定量PCT抗原的牛血清白蛋白(第五组分)(简称BSAV)溶液，所述
标准品的浓度为0(S0)、0.1(S1)、1(S2)、5(S3)、50(S4)、100(S5)ng/ml，所述
质控品的浓度为0.6,50ng/ml，所述校准品的浓度为1,50ng/ml；清洗浓缩液：含有
Tween-20和Proclin-300的缓冲液；稀释液：含有牛血清白蛋白(第五组分)(简称BSA
V)的溶液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530
的浓度为10μg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种降钙素原测试试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由下述体积
分数组成：磁分离试剂4％-6％，试剂R14％-6％，试剂R24％-6％，标准品4％-6％，质控品1％-3％，
校准品1％-3％，清洗浓缩液20％-30％，稀释液10％-20％，发光底物25％-40％。
3.根据权利要求2所述的一种降钙素原测试试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由下述体积
分数组成：磁分离试剂4％，试剂R14％，试剂R24％，标准品4％，质控品1％，校准品3％，
清洗浓缩液30％，稀释液20％，发光底物30％。
4.根据权利要求2所述的一种降钙素原测试试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由下述体积
分数组成：磁分离试剂5.1％，试剂R15.1％，试剂R25.1％，标准品5.1％，质控品1.8％，
校准品1.8％，清洗浓缩液25％，稀释液17％，发光底物34％。
5.根据权利要求2所述的一种降钙素原测试试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由下述体积
分数组成：磁分离试剂6％，试剂R16％，试剂R26％，标准品6％，质控品3％，校准品1％，
清洗浓缩液20％，稀释液12％，发光底物40％。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种降钙素原测试试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各
组分按照如下制备方法制得：
第一步：磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作规程：
(1)称取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96gTween-20于20ml容器中加适
量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L
容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(3)调节PH计测量其PH值；用4MHCl或4MNaOH调PH，测量其PH在7.95－8.05之间即
符合要求；
(4)称取BSAV(牛血清白蛋白(第五组分))3g倒入上述1L容器中；
(5)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95－8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过
滤即得；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；
二、磁分离试剂的配制：
(1)将1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ulDMSO中，即浓度为20mg/mL；取2mgPCT
抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml；
(2)计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；
(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离
心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；
(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直径在0.9-1.5μm之间，加入5ml反应杯中，放入专用试
管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将
步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；
(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分钟，其中Tris的加样量为1mg抗体加
0.15mlTris；
(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，
重复操作3次；
(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的PCT磁分离试剂；
(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1：2的比例混匀，即得本发明试剂盒中
磁分离试剂；
第二步：试剂R1的制备过程
一、试剂R1稀释液配制操作规程：
(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于烧瓶
中；然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(2)用4MHCl或4MNaOH调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；
(3)称取BSAV3g倒入上述烧瓶中；
(4)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱驰，王键，
申请(专利权)人：北京豪迈生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11