游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒及其测试方法技术

本发明专利技术公开了一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液及发光底物组成，本发明专利技术还公开了该试剂盒的制备方法。本发明专利技术试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有酶联免疫的技术相比，本发明专利技术具有更高的特异性，灵敏度，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠，大大降低了产品成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中游离人绒毛膜性腺激素β亚单位含量的试剂盒及其测试方法。
技术介绍
人绒毛膜促性腺激素(hCG)是一种胎盘滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，由α亚基和β亚基组合而成。两种亚基均可以游离态出现在血液中。hCGα亚基与垂体糖蛋白激素的α亚基相同，用免疫学方法无法将它们区别开，而hCG的β亚基是hCG的特有结构，也决定了其分子的生物学和免疫学特性，分子量为22.2KD。在整个怀孕过程中，游离F-β-hCG通常是随完整的hCG一起出现和增长，所以游离β-hCG是诊断早孕的一项重要的检测指标，其分泌与滋养细胞的数量密切相关。血清F-β-hCG测定还能诊断异位妊娠、先兆流产、葡萄胎及滋养细胞肿瘤，而且也是治疗后的及预后观察的重要检测指标，对其他疾病如卵巢生殖细胞肿瘤、男性肇丸肿瘤，非滋养细胞疾病、非生殖细胞也有辅助诊断意义。从检测角度上来说，目前临床上用于测定F-B-hCG的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。过去以放免为代表的人绒毛膜促性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场；酶联免疫法(ELISA)作为定性检测的方法，抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，其灵敏度、特异性均较好，且经济实惠，所以是应用得最广、最多的方法。化学发光法其灵敏度高，从化学角度和自动化程度看，化学发光法优于酶联免疫法。这些方法虽然都有很多优点，但在检测的灵敏度、特异性、稳定性、检测用时等方面还有待进一步提高。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果稳定可靠的的游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)的测试试剂盒及其测试方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体，所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量F-β-hCG抗原的小牛血清溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml，所述质控品浓度为10,80mIU/ml，所述校准品浓度为15,80μIU/ml；清洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位(F-β-hCG)测试试剂盒，由下述体积分数组成：磁分离试剂5％-7％，试剂R15％-7％，试剂R25％-7％，标准品5％-7％，质控品1％-3％，校准品3％-6％，清洗浓缩液20％-40％，发光底物30％-50％。优选地，一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，由下述体积分数组成：磁分离试剂5％，试剂R15％，试剂R25％，校准品5％，质控品1％，校准品3％，清洗浓缩液26％，发光底物50％。优选地，一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，由下述体积分数组成：磁分离试剂6％，试剂R16％，试剂R26％，校准品6％，质控品2％，校准品4％，清洗浓缩液30％，发光底物40％。优选地，一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，由下述体积分数组成：磁分离试剂7％，试剂R17％，试剂R27％，校准品7％，质控品3％，校准品6％，清洗浓缩液33％，发光底物30％。所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得：第一步：磁分离试剂的制备过程一、磁珠缓冲液配制操作规程：(1)称取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96gTween-20于20ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；(3)调节PH计测量其PH值；用4MHCl或4MNaOH调PH，测量其PH在7.95－8.05之间即符合要求；(4)称取BSAV(牛血清白蛋白(第五组分))3g倒入上述1L容器中；(5)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95－8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤即得；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；二、磁分离试剂的配制：(1)将1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ulDMSO中，即浓度为20mg/mL；取2mgF-β-hCG抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml；(2)计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/CDSS)，其中CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直径在0.9-1.5μm之间，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分钟，其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris；(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的F-β-hCG磁分离试剂；(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1：2.3的比例混匀，即得本专利技术试剂盒中磁分离试剂；第二步：试剂R1的制备过程一、试剂R1稀释液配制操作规程：(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于烧瓶中；然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；(2)用4MHCl或4MNaOH调PH，测量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标记有小鼠抗人F‑β‑hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人F‑β‑hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的F‑β‑hCG抗体，所述碱性磷酸酶标记的F‑β‑hCG抗体的浓度为0.2μg/ml；试剂R2：含有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量F‑β‑hCG抗原的小牛血清溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200(S5)mIU/ml，所述质控品浓度为10,80mIU/ml，所述校准品浓度为15,80mIU/ml；清洗浓缩液：含有Tween‑20和Proclin‑300的缓冲液；发光底物：金刚烷的衍生物IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。

【技术特征摘要】
1.一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试
剂R2，标准品，质控品，校准品，清洗浓缩液及发光底物组成，其中：磁分离试剂：标
记有小鼠抗人F-β-hCG的单克隆抗体的纳米磁性微球，所述标记有小鼠抗人F-β-hCG
的单克隆抗体的纳米磁性微球浓度为100μg/ml；试剂R1：含有碱性磷酸酶标记的
F-β-hCG抗体，所述碱性磷酸酶标记的F-β-hCG抗体的浓度为0.2μg/ml；试剂R2：含
有牛γ球蛋白质组分的缓冲液；标准品，质控品和校准品：含有一定量F-β-hCG抗原的
小牛血清溶液，所述标准品的浓度为0(S0)、5(S1)、15(S2)、40(S3)、80(S4)、200
(S5)mIU/ml，所述质控品浓度为10,80mIU/ml，所述校准品浓度为15,80mIU/ml；清
洗浓缩液：含有Tween-20和Proclin-300的缓冲液；发光底物：金刚烷的衍生物
IUMIPHOS530，所述金刚烷的衍生物IUMIPHOS530的浓度为10μg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒由下述体积分数组成的：磁分离试剂5％-7％，试剂R15％-7％，试剂R25％-7％，
标准品5％-7％，质控品1％-3％，校准品3％-6％，清洗浓缩液20％-40％，发光底物30％-50％。
3.根据权利要求2所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒由下述体积分数组成的：磁分离试剂5％，试剂R15％，试剂R25％，校准品5％，
质控品1％，校准品3％，清洗浓缩液26％，发光底物50％。
4.根据权利要求2所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒由下述体积分数组成的：磁分离试剂6％，试剂R16％，试剂R26％，校准品6％，
质控品2％，校准品4％，清洗浓缩液30％，发光底物40％。
5.根据权利要求2所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒由下述体积分数组成的：磁分离试剂7％，试剂R17％，试剂R27％，校准品7％，
质控品3％，校准品6％，清洗浓缩液33％，发光底物30％。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种游离人绒毛膜性腺激素β亚单位测试试剂盒，其特征
在于：所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得：
第一步：磁分离试剂的制备过程
一、磁珠缓冲液配制操作规程：
(1)称取Tris4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96gTween-20于20ml容器中加
适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；
(2)用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述
1L容器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(3)调节PH计测量其PH值；用4MHCl或4MNaOH调PH，测量其PH在7.95－8.05之间
即符合要求；
(4)称取BSAV(牛血清白蛋白(第五组分))3g倒入上述1L容器中；
(5)最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95－8.05之间即符合要求，用0.2um滤器
过滤即得；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存；
二、磁分离试剂的配制：
(1)将1.0mgDSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于50ulDMSO中，即浓度为20mg/mL；取
2mgF-β-hCG抗体溶于PH9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至总体积为1ml；
(2)计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/CDSS)，其中
CDSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；
(3)用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；
(4)将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中,然后放入到sigma2-16k高速冷冻
离心机中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；
(5)取0.5ml磁珠，所述的磁珠直径在0.9-1.5μm之间，加入5ml反应杯中，放入专用
试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；
(6)每次加入1.5mlPH9.50.1mol/LPB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；
将步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；
(7)加入0.3ml1mol/L的Tris溶液37℃15分钟，其中Tris的加样量为1mg抗体加
0.15mlTris；
(8)每次加入1.5mlPH7.20.1mol/LPB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上
清，重复操作3次；
(9)用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的F-β-hCG磁分离试剂；
(10)将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1：2.3的比例混匀，即得本发明试剂
盒中磁分离试剂；
第二步：试剂R1的制备过程
一、试剂R1稀释液配制操作规程：
(1)取Tris6.06g、NaCl13.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml和MgCl20.05g于烧
瓶中；然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；
(2)用4MHCl或4MNaOH调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；

【专利技术属性】
技术研发人员：朱驰，王键，
申请(专利权)人：北京豪迈生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11