一种检测猪瘟病原的方法技术

一种检测猪瘟病毒的方法，其特征在于：　　　　按照扩增猪瘟病毒基因的方法，设计４条特异性寡核苷酸引物（Ｃ１～Ｃ４）和１条生物素标记的杂交捕获探针（Ｃ５）；　　　　从被检样品中按提取猪瘟病毒ＲＮＡ的方式提取ＲＮＡ；　　　　以提取的ＲＮＡ为模板，反转录合成ｃＤＮＡ；　　　　用所述４条特异性寡核苷酸引物（Ｃ１～Ｃ４），进行套式聚合酶链式扩增反应扩增，并将其产物用地高辛标记的ｄＵＴＰ标记；　　　　将所述探针与扩增产物杂交并捕获到微量载体板孔中；　　　　加入过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和底物进行免疫显色；　　　　测定４０５ｎｍＯＤ值（Ａ↓［４０５］）并判读结果，Ａ↓［４０５］≥０．１者为阳性。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测猪瘟病毒的方法，特别是利用反转录-聚合酶链式扩增反应技术(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)技术检测猪瘟病毒的方法。
技术介绍
猪瘟是严重危害养猪业的重要传染病之一，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病。猪瘟病毒(CSFV)的感染，可导致各生长阶段猪的死亡，目前，我国每年因猪瘟病死的生猪占年饲养总数的3％左右，这不仅造成了巨大的经济损失，而且也阻碍了我国猪肉制品走向国际市场。由于C-株疫苗的长期使用，有效地控制了猪瘟的急性发作和大流行。但从上世纪70年代末以来，我国猪瘟的流行特点发生了很大的变化，出现了温和性猪瘟和持续带毒现象，感染猪的临床症状不典型，难以诊断，疫苗免疫剂量加大了数倍，仍有相当数量的猪处于免疫水平低下的易感状态。近些年猪瘟的发生表现更加复杂，既有区域性大流行，又有零星散发，既有高死亡率的急性症状，又有持续感染的温和性症状。猪瘟的这一变化给防制工作带来了很大困难，貌似健康的感染猪通过流通渠道水平传播猪瘟，而由感染种猪引起的死胎、流产对猪的繁育造成严重影响，侥幸存活的带毒仔猪又成为新的传染源。目前，检测猪瘟病原的方法主要包括病毒分离法、荧光抗体检测法、病毒分离及中和试验法。但时，由于温和性猪瘟或持续带毒者组织中病毒含量低，常常难以用病毒分离等方法检测到病原，用荧光抗体检测组织切片或抹片检测，其操作复杂，设备要求较高，结果判断主观性强，难以掌握；病毒分离及中和试验虽然准确、特异，但操作繁琐，要花费较长的时间。目前，人们已经了解了与猪瘟病毒有关的基因结构，其中猪瘟病毒基因组N(5′)端非编码区(CSFV 5′UTR)比较保守，被广泛用于特异性猪瘟病毒的扩增。扩增时，一般设计了4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)和1条生物素标记的杂交捕获探针(C5)(Arch Virol，1994，139217-229；J Virol Methods，2001，95101-110)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述缺陷，提供一种检测猪瘟病毒的快速、敏感的检测方法。为了达到该目的，本专利技术所采取的技术方案步骤如下按照扩增猪瘟病毒基因的方法，设计4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)和1条生物素标记的杂交捕获探针(C5)；从被检样品中按提取猪瘟病毒RNA的方式提取RNA；以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；用所述4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)，进行套式聚合酶链式扩增反应扩增，并将其产物用地高辛标记的dUTP标记；将所述探针与扩增产物杂交并捕获到微载体板上；加入过氧化物酶标记的抗地高辛抗体和底物进行免疫显色；测定405nm OD值(A405)并判读结果，A405≥0.1者为阳性。本专利技术将高敏感的RT-PCR技术、非放射性标记技术和ELISA技术相结合，在本文中称为RT-PCR-ELISA，提高了检测猪瘟病原的敏感性，较常规RT-PCR方法高100倍，可检出350μL1∶100稀释(相当于3.5mg)的兔脾组织悬液中的猪瘟兔化弱毒捕获探针的应用增强了其特异性，只能捕获CSFV cDNA而与其他cDNA无交叉反应，克服了PCR过程中可能的污染导致的假阳性；用本方法检测C-株兔脾组织毒、细胞适应毒和野毒感染的猪组织毒样品，效果良好。本专利技术可用于猪瘟的早期诊断和隐性带毒者的查毒。具体实施例方式1)设计引物和探针设计了4条特异性寡核苷酸引物(C1～C4)和1条生物素标记的杂交捕获探针(C5)，均采用Takara公司合成，其序列见表1。表1引物和探针的序列及位置 *上述数字区间表示对应引物或探针在猪瘟病毒株Alforlt A19基因组中的位置(基因库中毒株Alforlt A19的序列号为U90951)2)提取RNA 用从GIBCOBRL公司购得的TRIZOL试剂作为组织裂解液，按该产品使用说明操作，分别从中国农业科学院兰州兽医研究所采集保存的样品(包括脾组织、血液、组织培养细胞等)中提取RNA，其中C-株兔脾组织毒(Cst)、石门株PK15细胞传代毒(SMpk)和C-株PK15细胞传代毒(Cpk)以及1997～1999年期间采集的6株田间野毒株(Gszy/99、GSjc/97、Gshy/98、HN/99为猪脾组织毒，GSlx/98、GSlt/98为猪血毒)。3)反转录合成cDNA取所提取的RNA 5～10μl，加入20μl反转录体系中，内含1×RT buffer(50mMTris-HCl(pH8.3)、75nM KCl、8mMMgCl2、10mM DTT)、引物C4 50pmol、购自Takara公司的单核苷酸dNTP每种10mM、AMV RTase 10U、RNA酶抑制剂(RNase inhibitor)20U。在42℃下水浴1h，然后煮沸5min，置-20℃备用。4)套式PCR(nest-PCR)并将其产物用地高辛标记在PCR过程中掺入地高辛标记的dUTP(购自Roche公司)，使PCR产物标记以地高辛。取5μl反转录产物加入50μl PCR反应体系中，内含1×PCR buffer(10mMTris-HCl，50mM KCl，1.5mM MgCl2pH8.3)0.2mM dATP，dCTP，dGTP，0.19mMdTTP，0.01mM DIG-dUTP，250nM特异性引物C1/C4。PCR循环参数为94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，第一循环94℃5分钟，最后一循环72℃延伸8分钟。35个循环完成扩增反应。取第一次PCR产物0.5μl作为模板，用引物C2/C3进行第二次扩增，反应体系及循环参数同第一次扩增。每次反应均设阳性对照、阴性对照和空白对照。这样用两对引物C1/C4、C2/C3成功扩增了与预计长度相符的猪瘟cDNA片段，并用探针C5成功捕获所扩增的片段。经特异性测定结果表明，以正常PK15细胞和健康兔脾组织毒作平行对照，该方法具有很强的特异性。5)RT-PCR-ELISA检测在20μl变性液中加入5μl地高辛标记的PCR产物，混匀，置室温(15～25℃)10分钟。然后加含10pmol/ml生物素(购自Takara公司)标记捕获探针(C5)的杂交液至250μl，混匀后取200μl加到链亲和素(购自Roche公司)包被的微孔中，在45℃振荡培养3小时。用洗液洗3次，每次用250μl洗液，甩干后加200μl工作浓度(1∶100)的抗地高辛过氧化物酶(Anti-DIG-POD)(购自Roche公司)，在37℃暗室中振荡培养30分钟。如前洗5次后加200μl ABTS底物溶液，在37℃暗室中振荡培养30分钟。在405nm测OD值。每次反应均设阳性对照、阴性对照和空白对照。阴性对照的A405应在0.1以下，A405≥0.1者为阳性。6)测定结果6.1)敏感性将C-株兔脾组织毒用生理盐水以1∶1研磨，匀浆液以1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶100、1∶200稀释，各取350μl提取RNA。RT-PCR ELISA检测结果表明，可从1∶100稀释的该组织悬液中检测到猪瘟病毒。同时，将地高辛标记的猪瘟阳性PCR产物做10倍系列稀释，各取5μl分别经琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR ELISA方法检测。结果显示，琼脂糖凝胶电泳可检测到1∶10，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘湘涛，孙世琪，谢庆阁，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：