猪瘟病毒疫苗和诊断制造技术

本发明专利技术涉及含有猪瘟病毒特征性多肽的猪瘟病毒疫苗。还涉及能够表达编码该多肽之核酸顺序的载体疫苗。所说的多肽和核酸顺序也能用于检测猪瘟病毒感染。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及核酸顺序、含有该核酸顺序的重组核酸分子，含有这样一个重组核酸分子的重组表达系统、猪瘟病毒特有的多肽、含有这样一种多肽或重组表达系统的疫苗以及制备这种疫苗的方法。在世界上许多国家，猪瘟(HC)一直是有着经济上重要性的猪疾病。在自然条件下，猪是已知的易感HC的仅有动物。猪瘟是有高度传染性的疾病，其可引起毛细血管壁的退化，导致内脏出血和坏死，发病初期，猪瘟的特征是发烧、厌食、呕吐和腹泻，进而出现以母猪不育、流产和仔猪发育不良为特征的慢性疾病过程。但几乎所有的猪均在早期出现症状后2周内死亡。已证明猪瘟的病原体猪瘟病毒(HCV)在结构和血清学上与牛的病毒性腹泻病毒(BVDV)及羊的边地病病毒(BDV)有关。这些病毒属于披膜病毒科内的瘟病毒属。很早就知道瘟病毒的遗传物质是RNA，即缺乏重要聚腺苷酸化的正股RNA。HCV可能包含3-5种结构蛋白质，其中两种可能是糖基化的。尚不知道非结构病毒蛋白质的数目。已经制成并且使用了对抗HC感染的修饰的HCV疫苗(包括减毒或杀死的病毒)。然而，因为在所说的修饰的病毒疫苗中，使用的是感染组织培养细胞所得到的HCV材料，故病毒产率很低而且病毒颗粒难于纯化。使用修饰的活病毒疫苗时，因使用了部分减毒的病原性HCV接种动物，故可因病毒仍有致病力而引起被接种动物或其子代患病，并可能在疫苗中污染其他病毒。另外，减毒的病毒还可能逆转成为强毒力状态的病毒。使用失活的疫苗还有其他一些缺点，如存在因病毒部分地失活所造成的危险、只能达到低免疫水平而须追加免疫的问题、以及因失活处理改变了抗原决定基而造成失活病毒之免疫原性差的问题。此外，使用修饰的HCV疫苗不适于根除治疗。据我们所知，迄今为止还没有一种鉴别猪的HCV和BVDV感染的诊断试验。建立这一试验方法是很重要的，因为猪的BVDV感染没有HCV感染后果严重或受人重视，即意味着BVDV感染的猪还没有被消除。含有必要和相关HCV免疫原性物质的疫苗，应能在不表现出上述修饰疫苗之缺点的情况下引发抗病原体的免疫反应。根据本专利技术，现已找到了编码猪瘟病毒所特有之多肽的核酸顺序。所说核酸顺序或所说的多肽的片段也属于本专利技术范围之内。可使用该核酸顺序和多肽或其片段制备用于对抗HCV感染的、只含有必需和相关免疫原性物质的动物疫苗。“核酸顺序”是指核糖核酸顺序和脱氧核糖核酸顺序。图2中显示了本专利技术的核酸顺序。如众所周知，鉴于遗传密码的简并性，可以在仍不改变被编码的氨基酸的情况下产生密码子中碱基的取代，如编码谷氨酸的密码子可以是GAT或GAA。因此，显然可以使用与图2中所示核酸顺序不同的核酸顺序(即具有可替代的密码子组成)来表达具有图2所示之氨基酸顺序的多肽。包括于本专利技术范围内的还有在严格条件下与图2所示核酸顺序杂交的核酸顺序。这些核酸顺序与图2中所示者有关，但可能包括核苷酸取代、突变、插入、缺失等。并且可编码图2所示之多肽的功能上的等同物，即编码的相关多肽的氨基酸顺序与图2所示的氨基酸顺序不完全相同，但表现有HCV特有的相应免疫学性质。本专利技术还包括由这些相关核酸顺序编码的多肽。图2中所示的核酸顺序是由HCV的基因组RNA得到的CDNA顺序。该连续顺序长度为12284个核苷酸，其含有一个由364-366位ATG密码子开始，并终止在12058-12060位转译终止密码子TGA的长开放读码(ORF)。该ORF是由能编码435KD蛋白质的3898个密码子组成的。在体内，HCV在被感染的细胞中复制期间，该蛋白质是作为多聚蛋白质前体分子合成的，继后经酶促裂解该前体分子而加工成片段多肽。经过可能的转译后修饰，这些片段形成病毒的结构或非结构蛋白质。优选的核酸顺序含有这种抗HCV免疫特性或HCV特有之免疫学性质的片段的遗传信息，或含有仍可表现抗HCV免疫特性或HCV特有之免疫学性质的该片段的一部分的遗传信息。依据图2之多肽的片段多肽和其部分-其可用于免疫动物对抗HC或用于诊断HC-也构成本专利技术的一个部分。片段编码区位于氨基酸位序约1-249、263-487、488-688或689-1067之间。1-249区域基本上代表核心蛋白，而263-487、488-688和689-1067区域则基本上分别代表33KD、44/48KD和55KD糖蛋白。本专利技术还包括含有上述一个或多个编码区或其部分的遗传信息的核酸顺序。掺入抗HCV感染之疫苗中的优选区域是相当于HCV之55KD蛋白质或其仍具有免疫活性之部分的区域。此外，本专利技术可优先选用至少包括上述55KD蛋白质或其部分之编码顺序的核酸顺序。再者，可使用具有病毒中和活性的抗55KD蛋白的单克隆抗体来分析HCV缺失突变体，以检测可用于免疫猪以对抗HCV感染的HCV55KD蛋白之优选部分。该部分包含约跨越氨基酸顺序812-859的抗原决定基，并且是由核苷酸顺序2799-2938编码的。至少包含所说氨基酸顺序的多肽或至少包含所说核苷酸顺序的核酸顺序也构成本专利技术的一部分内容。可用于诊断猪的HCV感染并用于鉴别HCV和BVDV的本专利技术的核酸顺序可由编码55KD蛋白质的基因得到。最好由核苷酸顺序2587-2619或2842-2880得到该核酸顺序，上述两顺序都是编码55KD蛋白质之基因的一部分。用于诊断目的的优选寡核苷酸是5′－CCTACTAACCACGTTAAGTGCTGTGACTTTAAA-3′或5′-TTCTGTTCTCAAGGTTGTGGGGCTCACTGCTGTGCACTC-3′至少包含该寡核苷酸之亚顺序且仍可用于区分HCV和BVDV的核酸顺序也属于本专利技术的范围。本专利技术还涉及用于检测试验的试验药盒，该试验药盒包含本专利技术的核酸顺序。试验药盒最好包含上述寡核苷酸或至少含有其亚顺序的核酸顺序。在仍保留同样免疫学性质的情况下，图2所示的多肽或其片段可以发生变异或修饰，如不同毒株或其他衍生物之间的自然变异。可根据整个顺序中氨基酸差异或所说多肽中氨基酸的缺失、取代、插入、倒位或加入来证明这些变异。此外，在使用DNA重组技术制备图2所示多肽或其片段的不同衍生物时，还可能因所得的单个或多个氨基酸取代、缺失、加入或置换(如借助基础DNA的位点特异性诱变)而发生不同的修饰。所有这些经修饰的图2所示多肽或其片段的衍生物，只要所说多肽或其片段的必需特有活性保持不变，也都包括在本专利技术的范围内。从沉淀之病毒颗粒中分离RNA并用于合成CDNA。在噬菌体λgt11中克隆该CDNA，扩增个别CDNA库并用羊抗HCV抗血清筛选之。可鉴定出两个阳性克隆并证明具有两个大小为0.8Kb和1.8Kb的插入段。测定了0.8Kbλgt11插入段的部分顺序(见图3)并确定其位于HCV基因组上的约1.2和2.0Kb之间(见图2)。根据本专利技术，可用于诊断动物的HCV感染并可用于鉴别HCV与BVDV的核酸顺序是由图2所示的核苷酸顺序5551-5793代表的。至少包含所说核苷酸顺序的亚顺序，并仍可用于区分HCV和BVDV的核酸顺序也构成本专利技术的一个部分。本专利技术还涉及用于检测分析的试验药盒，该试验药盒包含根据本专利技术的核酸顺序。该试验药盒最好包含由图2所示的核苷酸顺序5551-5793所代表的核酸顺序，或至少包含上述其亚顺序的核酸顺序。从病毒粒子沉淀物中分离RNA并用于合成CDNA。在噬菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码猪瘟病毒特征性多肽的核酸顺序。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：格来哥梅伊尔，迪尔曼鲁麦纳普，享茨余尔根歇尔，
申请(专利权)人：阿克佐公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]