本发明专利技术公开了一种试剂盒，该试剂盒包括一个扩增试剂、一个初筛探针试剂和4个复筛探针试剂。本发明专利技术还公开了一种检测猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒的方法。在实际检测中，本发明专利技术所提供的试剂盒和方法能够在6小时内完成样品中上述几种病毒的筛查，大量阴性样本可以通过初筛阶段判定为阴性而不进入复筛阶段，可大大提高检测效率，节省大量时间、人力和物力，并且，初筛后的阳性结果待确认样本，可以在复筛过程中通过特异性捕获探针获得相应病毒阳性结果的最终判定确认，同时本发明专利技术所提供的方法具有较高灵敏性、特异性，适合于对待测样品的快速筛查。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种试剂盒，该试剂盒包括一个扩增试剂、一个初筛探针试剂和4个复筛探针试剂。本专利技术还公开了一种检测猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒的方法。在实际检测中，本专利技术所提供的试剂盒和方法能够在6小时内完成样品中上述几种病毒的筛查，大量阴性样本可以通过初筛阶段判定为阴性而不进入复筛阶段，可大大提高检测效率，节省大量时间、人力和物力，并且，初筛后的阳性结果待确认样本，可以在复筛过程中通过特异性捕获探针获得相应病毒阳性结果的最终判定确认，同时本专利技术所提供的方法具有较高灵敏性、特异性，适合于对待测样品的快速筛查。【专利说明】猪瘟、猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方 法
本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种猪瘟、猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎病毒 检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
核酸序列依赖性扩增检测技术（Nuclear acid sequence-based amplification, NASBA)是一项以核苷酸模板序列为模板进行等温核酸扩增 的检测方法（Compton, J·，Nucleic acid sequence-based amplification. Nature, 1991. 350(6313) :p. 91-92.)，该方法的扩增过程是由一对特异性引物介导的、连续 均一的等温酶促扩增反应过程。NASBA法扩增反应简单快速，约2小时可将RNA扩增IO 9至 IO12倍，相比常规PCR反应扩增产物量至少高1000倍，且不需要特殊的大型仪器。NASBA 扩增反应的高效性还在于扩增过程受到初始样本中RNA浓度的影响很小，反应在42°C下进 行，扩增产物的积累量与时间呈指数相关，扩增产物达到IO 5倍仅需15分钟，而PCR扩增则 需要85分钟。 猪瘟病毒(又名古典猪瘟病毒Classical Swine Fever Virus，CSFV)是威胁养猪 业的一种主要传染病。尽管分离到不同的变异性毒株，但目前认为猪瘟病毒为单一血清型 (Kaden, V. and B. Riebe, Classical swine fever (CSF):ahistorical review of research and vaccine production on the Isle of Riems. Berl Munch Tierarztl ffochenschr, 20 01. 114(7-8) :p. 246-251)。 猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)又称猪蓝耳病病毒，依据血清学及基因序列分析，分为以LV型为代 表的欧洲型亚型和以VR2332为代表的美洲型亚型，这两种不同基因型的病毒的核苷酸序 列同源性约为 GO^KShang, Y.，et al·，Pathogenic characteristics of three genotype II porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated from China. Virol J，2013. 10:p. 7.)(张松林等，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的免疫学和免疫逃避研 究进展，病毒学报，2012. 28(6) :p. 689-698.)。 猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV) 也是一种高度接触性传染性动物病毒，到目前为止，世界各地所分离的TGEV毒株均属同一 个血清型（Laude, H.，et al. , Molecular biology of transmissible gastroenteritis virus. Vet Microbiol, 1990. 23(1-4):p. 147-154. )〇 目前，虽然有利用NASBA技术对这三种病毒的单一检测方法已有所报道，但是还 没有通过一次NASBA扩增而筛查出待测样品中是否存在上述病毒中的一种或几种的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服目前存在的不能通过一次性检测得知样品中是否存在猪 瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒中的 一种的缺陷，提供了一种试剂盒和一种猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒 美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒检测方法。 根据本专利技术所提供的试剂盒，该试剂盒包括一个引物扩增试剂、一个初筛探针试 剂和4个复筛探针试剂； 其中，所述引物扩增试剂中包括3个引物对： 第一对引物对由SEQ ID NO: 1所示的引物和SEQ ID NO:2所示的引物组成， 第二对引物对由SEQ ID N0:3所示的引物和SEQ ID N0:4所示的引物组成， 第三对引物对由SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的引物组成， 其中，所述初筛探针试剂中包含5个初筛探针，所述5个初筛探针的序列分别为 SEQ ID NO:7 至 SEQ ID NO: 11 所示的探针； 其中，所述4个复筛探针试剂分别含有一个复筛探针对： 第一对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 13所示的探针组成， 第二对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 14所示的探针组成， 第三对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 15所示的探针组成， 第四对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 16所示的探针组成， 其中，SEQ ID NO: 7以及SEQ ID NO: 13至SEQ ID NO: 16的5'末端标记有生物素 分子，SEQ ID NO:8至SEQ ID NO: 12的5'末端标记有地高辛分子。 根据本专利技术所提供的猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型 亚型和猪传染性胃肠炎病毒的检测方法，该方法包括以下步骤： (1)在dNTP、NTP、T7RNA聚合酶、AMV、RNaseH和NASBA缓冲液存在下，使扩增试剂 与待测核酸样本在NASBA反应条件下进行第一接触，得到第一接触后的产物； (2)将第一接触后的产物与初筛探针试剂在杂交条件下在SSPE杂交缓冲液中进 行第二接触，得到第二接触后的产物；所述初筛检测探针能够与所述单链RNA扩增产物的 单链RNA杂交； (3)将第二接触后的产物与含有抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体的检测试剂进 行第三接触，获得第三接触后产物； (4)将第三接触后的产物先后在显色条件和终止条件下分别与显色反应试剂和终 止显色反应试剂进行第四接触和第五接触，得到第五接触后的产物； (5)测定第五接触后的产物在405nm处的光密度值X，并判断该光密度值是否大于 等于临界值a，其中，临界值a的计算方法为：按照步骤（1) - (4)所述的方法对不少本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种试剂盒，该试剂盒包括一个扩增试剂、一个初筛探针试剂和4个复筛探针试剂；其中，所述扩增试剂中包括3个引物对：第一对引物对由SEQ ID NO:1所示的引物和SEQ ID NO:2所示的引物组成，第二对引物对由SEQ ID NO:3所示的引物和SEQ ID NO:4所示的引物组成，第三对引物对由SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的引物组成，其中，所述初筛探针试剂中包含5个初筛探针，所述5个初筛探针的序列分别为SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:11所示的探针；其中，所述4个复筛探针试剂分别含有一个复筛探针对：第一对复筛探针对由SEQ ID NO:12所示的探针和SEQ ID NO:13所示的探针组成，第二对复筛探针对由SEQ ID NO:12所示的探针和SEQ ID NO:14所示的探针组成，第三对复筛探针对由SEQ ID NO:12所示的探针和SEQ ID NO:15所示的探针组成，第四对复筛探针对由SEQ ID NO:12所示的探针和SEQ ID NO:16所示的探针组成，其中，SEQ ID NO:7以及SEQ ID NO:13至SEQ ID NO:16的5’末端标记有生物素分子，SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:12的5’末端标记有地高辛分子。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈春英，陈瑞，邱杨，聂福平，刘杰，黄伟，刘建丽，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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