猪瘟抗体ELISA诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种猪瘟病毒的ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒。本发明专利技术是应用基因拼接技术在猪瘟病毒Ｅ２基因的两侧加上分泌信号肽序列和纯化标签，并嵌合至苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒表达载体中，构建重组苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２６７１，获得包被ＥＬＩＳＡ板猪瘟病毒石门株Ｅ２基因可溶性表达抗原。使用本发明专利技术所涉及的试剂盒对猪瘟诊断及免疫评价快速、敏感、特异，可在２ｈ内完成一次检测。

【技术实现步骤摘要】
猪瘟抗体ELISA诊断试剂盒
专利技术涉及一种猪瘟抗体ELISA诊断试剂盒，属于动物用生物制品制造领域。技术背景猪瘟又称经典猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)，是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)引起猪的高度致死性、接触性传染病。是世界粮农组织和各国政府密切关注的 主要传染病之一。根据0IE制定的《陆生动物卫生法典》2005年版，CSF被列为法定报告的 疫病之一，在我国被列为"一类动物疫病"，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。世界各国都将猪瘟防疫列为国家动物卫生行政工作的重点，采取预防、防疫及检疫措施， 以提高养猪产业的收益。在发达国家，以全场扑杀的方式，成功地扑灭猪瘟，成为非猪瘟区； 我国则采取免疫、检疫和淘汰带毒猪的综合防疫措施，促进建立无规定动物疫病区，保证养 猪业迅速、稳定发展，以点带面，从而达到全面消灭猪瘟的目标，因此猪瘟兔化弱毒疫苗依 然是我国用于猪瘟预防控制的唯一手段。通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序 是提高群体免疫水平的保证，为猪瘟的综合防治提供了有力的技术支持。多年来，人们一直致力于猪瘟抗体检测试剂盒的开发。猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白是其的主 要中和性抗原蛋白，它在病毒多聚蛋白上的氨基酸序列为690aa 1063aa ，利用该蛋白进行 诊断抗体诊断技术的开发研究一致是人们研究的热点。为了获得猪瘟抗体用诊断抗原，先后 采用了原核表达E2抗原、真核表达E2抗原以及全病毒纯化等各种方法，但各有不同的问题。 主要原因有以下两个方面①原核表达抗原表达抗原为包涵体、敏感性差、酶联反应不稳 定；②全病毒纯化抗原采用过两种方法， 一种为硫酸铵沉淀法，另一种为超滤浓縮后超速离心法，但成本太高、技术难度大、产量极低，猪瘟病毒容易裂解等。在我国建立的方法也有ELISA方法、血凝抑制试验等，但均存在不稳定的特点。
技术实现思路
是采用基因工程手段，将猪瘟病毒E2基因进行改造以获得蛋白表达量高、稳定性好和免 疫原性特异的可溶性E2蛋白。采取的技术策略是应用基因拼接技术在猪瘟病毒E2基因的两 侧加上分泌信号肽序列和纯化标签，并嵌合至杆状病毒表达载体中，构建重组杆状病毒，获 得可溶性表达抗原，以用于抗体检测试剂盒的组装工作以及猪瘟单克隆抗体的筛选工作。应用基因拼接技术扩增出蜂素肽基因信号肽序列、多肽接头序列及6XHIS序列的融合 序列，并将此序列克隆至载体pFastbacl (Irwitrogen公司产品)，构建了一个命名为 pMEL-HIS的载体；应用基因拼接技术，将猪瘟病毒石门株E2基因(SME2)进行PCR扩增并突变，将突变后的 猪瘟病毒E2基因序列用EcoRI/SalI双酶切，克隆至载体pMEL-HIS,转化筛选、测序鉴定。 将构建的载体命名为pMEL-SE2M-HIS;将载体pMEL-SE2M-HIS转化大肠杆菌DH10Bac,与菌体中基因组重组后，经挑斑、PCR鉴 定，转染Sf9细胞，产生重组核型多角体病毒，此病毒命名为苜蓿银纹夜娥核型多角体病 毒(Autographa californica nuclear polydedrosis virus, AcMNPV)(参考黎路林编著.杆状 病毒表达载体系统.武汉华中师范大学出版社出版，pl页)VFBMEL-SE2M-HIS株(2008年9 月26日本病毒株已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No. 2671)。将此病毒培养物进行纯化鉴定，获得猪瘟病毒石门株E2基因可溶性表达抗原，此 抗原可用于组装猪瘟病毒抗体检测试剂盒。一、 构建路线构建含有猪瘟病毒基因E2基因的重组Ac廳PV VFBMEL-SE2M-HIS的pMEL-SE2M_HIS载 体的技术路线(见附图l)。二、 载体构建1.含信号肽及6 X HIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的构建设计4条引物，将信号肽序列、接头序列及6XHIS序列通过应用基因拼接(Gene splicing by over lap extension)技术进行PCR扩增，双酶切(BamHI/Kpnl) pFastBacl载体和PCR产 物，连接、转化筛选、测序鉴定。重建的载体命名为pMEL-HIS。(1) 引物序列为将上述引物稀释至lOOMm备用。(2) 具体操作过程如下1) 取2Xpfu Taq DNA polymerase mix(Tianz公司产品)20)4, MFP、 MRP各5W，无酶 水补至40W， 72。C反应30min。2) 取2Xpfu Taq DNA polymerase mix(Tianz公司产品)HFP、 HRP各，无酶 水补至40W， 72。C反应30min。3) 取2Xpfu Taq DNA polymerase mix(Tianz公司产品)20|4,第1、第2步反应产物 各1|4， MFP、HRP各lri，无酶水补至40W， 94。C预变性3min,然后94。C30sec， 55。C30sec, 72 。C10sec, 25cycles,最后72。C反应10min。4) 将PCR反应产物电泳，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。5) 将纯化回收的PCR产物及pFastBacl用BamHI/Kpnl双酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收 纯化。6) 将双酶切及纯化回收的PCR产物及pFastBacl载体连接，转化ToplO感受态细胞(Tianz 公司产品)，涂板、挑斑筛选。7) 将挑取的菌斑进行测序鉴定，证明pFastbacl中克隆的序列为CAGATTCCACGAA6T(nGGCGCCATGGGACATCACCATCACCATCAC6^7MO;克隆序列与设计序列一致。2. 突变序列的E2基因有文献报道，密码子的使用频率会严重影响基因的表达量，甚至不表达。E2基因在昆虫 细胞中的密码子使用频率低于20%高达40多处。设计了42条引物，应用基因拼接技术，将 SME2基因进行PCR扩增并突变。突变后基因的密码子使用频率均高于20%。突变后的序列克 隆至pGEM-T-easy(promega公司产品)中，获得的克隆命名为pBSE2M。用于突变反应的模板为带有SME2基因的质粒载体，构建过程参考文献(中国兽医学报 2005年V25(6) :564 566)进行。将突变后的序列克隆至pGEM-T-easy (promega公司产品)中进行测序验证，突变序列与 设计序列一致(参见附图2.石门株E2基因原始序列与突变序列比对)。3. AcMNPV重组质粒的构建以pBSE2M为模板，用引物E2MFP(带有EcoRI酶切位点)、E2服P(带有Sail酶切位点)重 新扩增，将扩增产物用EcoRI/SalI双酶切，和载体pMEL-HIS连接，转化筛选、测序鉴定。 克隆序列与设计的目标序列一致，将构建的载体命名为pMEL-SE2M-HIS。 (1)引物序列为E2MFP: AGTAGAATTCAGACTGGCCTGCAAGGAAGATTACAE2MRP: ACGTGTCGACCCAGTACTGATACTCGCCCTTCA (2)操作过程为1) 2Xpfu Taq DNA polymerase mix(Tianz公本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪瘟病毒的ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：经重组苜蓿银纹夜娥核型多角体病毒ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２６７１制备的抗原包被、封闭的ＥＬＩＳＡ板、ＨＲＰ标记ＭｃＡｂ、阳性血清对照、阴性血清对照、１０×ＰＢＳ、１０×ＰＢＳＴ、脱脂奶粉、ＴＭＢ显色液Ａ和Ｂ、０．７５％过氧化氢尿素溶液、终止液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：范学政，王琴，徐璐，赵启祖，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]