检测多种抗ＥＢ病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测多种抗ＥＢ病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒及其制备方法，该试剂盒主要包括有：至少一种包被有合成多肽的偶联亲和素的多色微球，和／或至少一种以上包被有天然的和／或基因工程抗原的偶联羟基多色微球；其中，天然抗原是ＥＢ病毒总抗原裂解物或壳抗原ＶＣＡ；基因工程抗原是系列表中Ｎｏ．３３～Ｎｏ．３７中的任一种的氨基酸系列；所述合成多肽是具有系列表中Ｎｏ．１～Ｎｏ．３２中任一种的氨基酸系列。它可适用于人群的筛查鼻咽癌的高发性评估诊断以及预后效果评价观察，可以直接应用于早期诊断鼻咽癌判断患者预后状况等方面。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药生物
，具体地是涉及检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒及制备方法。
技术介绍
鼻咽癌是流行于我国南方的一种恶性肿瘤，其中又以广东最为常见，年发病率达30-50/10万。早期鼻咽癌放疗后5年生存率可达80-90％；而晚期鼻咽癌仅为20％。因此加强鼻咽癌的二级预防，即早发现、早诊断、早治疗是提高鼻咽癌治疗效果的关键。鼻咽癌的发生与EB病毒感染密切相关。虽然普通人群中90％以上建立了EB病毒终生潜伏状态感染，但是鼻咽癌患者的多种EB病毒抗体水平要明显高于非患者。研究表明，鼻咽癌病人在临床症状出现前三年(平均)时，就可观察到其血清中多种抗EB病毒抗原抗体显著升高，因此免疫血清学检测EB病毒感染是目前筛查鼻咽癌最常用的手段。临床上普遍使用的检测指标是VCA/IgA、EA/IgA。VCA/IgA，其检测具有很高的灵敏度，但缺乏特异性，通常被用于筛查以排除鼻咽癌的诊断；而EA/IgA检测具有很高的特异度，但缺乏灵敏性而被用于鼻咽癌的确定性检测，两者可相互补充。近些年来，多种EB病毒基因工程重组抗原或化学合成多肽已被用于血清学检测，研究者发现了EBNA1、p18、p23、Rta、DNA聚合酶等若干种具有潜在诊断价值的EB病毒抗原。由于不同的鼻咽癌病人的抗体谱不完全相同，因此多种抗原抗体的联合检测可进一步提高其诊断性能。EBNA1/IgA、EBNA1/IgG、Zta/IgG单独检测时，其敏感度和特异度均在80-88％，比传统的VCA/IgA检测敏感性(93％)较低，但有较高的特异性；而比EA/IgA的特异性(97％)较低，但敏感性较高。当三者联合应用时，其敏感度和特异度不但大大提高，分别为92％、93-99％，而且可以用于鼻咽癌高发区健康人群筛查的风险评估，两种或三种抗体阴性时，其风险系数为0.009-0.3，两种阳性的风险系数为4-10，而三者均阳性时风险系数达到了138。由此可见，多种抗体联合检测比单独检测效果更好。自从EB病毒与鼻咽癌的关系被揭示以后，间接免疫荧光(IFA)检测血清VCA/IgA、EA/IgA被广泛采用。IFA的优点在于比较敏感特异，但是其结果的判断带有主观性，不易标准化，并且费时费力。随着检验技术的不断发展创新，研究者正在努力以其它技术如免疫斑点、免疫印迹、ELISA等代替IFA，其中ELISA方法最受重视。ELISA简单、快速、敏感，并且易于自动化，适于大规模筛选样本。已报道用于ELISA的EBV抗原包括感染EBV细胞的提取物、重组的EBV蛋白以及合成的多肽。ELISA每次一般只能对一种抗原/抗体进行分析，而单个指标不足以对所有鼻咽癌进行有效诊断。虽然有研究用ELISA法同时检测两种抗原获得了理想效果，但是三种以上同时包被同一个ELISA板还未见报道。如果要对多种抗原抗体同时进行分析，工作量就要大幅度增加，质控的难度也增加。如何高效快速地对多种EB病毒的抗体进行检测，是目前研究中的一个热点。多功能液相悬浮芯片(Multi-Analyte Suspension Array)是最近几年发展的高通量的分子诊断平台，其有机整合了流式细胞术、ELISA技术和芯片技术，一次可同时分析100种不同的因子。与其它检测方法相比，液相芯片技术具有灵敏度高，灵活性好，操作简便、快捷，标准曲线范围宽等优点。目前国外已有多种临床检测试剂盒面世，如肿瘤标志物检测、过敏原筛查、病原体的快速检测等。由于EB病毒感染引起鼻咽癌具有很强的地域特点，主要高发于我国南部，因此其早期诊断的技术在欧美国家并没有引起高度重视。由于EB病毒感染引起鼻咽癌具有很强的地域特点，主要高发于我国南部，因此其早期诊断的技术在欧美国家并没有引起高度重视。目前国内外还没有用于早期诊断鼻咽癌的液相芯片试剂盒商品。
技术实现思路
本专利技术的需要解决的技术问题之一是针对现有血清学检测方法上存在的不足，提供一种准确快速检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒。实现上述技术问题的技术方案如下一种检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒，主要包括有至少一种以上的包被有天然的或基因工程抗原的偶联羟基微球；和/或至少一种以上包被有合成多肽的偶联有亲和素的微球，其中，所述天然抗原是EB病毒总抗原裂解物或壳抗原VCA；基因工程抗原是系列表中NO.33～NO.37中的任一种的氨基酸系列；所述合成多肽是具有系列表中NO.1～NO.32中任一种的氨基酸系列。优选地，主要包括有分别包被有系列表中NO.9、NO.10、NO.12、NO.15、NO.18、NO.21、NO.23、NO.26或NO.30的合成多肽的偶联有亲和素的多色微球；和分别包被有EB病毒总抗原裂解物、壳抗原VCA、或系列表中NO.33～NO.37的氨基酸系列的偶联羟基的多色微球。本专利技术的进一步目的是提供上述检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒的制备方法。实现上述目的的技术方案如下一种制备上述的检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒的方法，主要包括以下步骤(1)包被天然的或基因工程抗原将0.5ml(共含有1.1×106个-1.3×106个微球)偶联羟基的多色微球放入Ep管中，室温离心；弃上清，重悬于activation buffer中；加入10μl 50mg/mlS-NHS、10μl 50mg/ml EDC，混匀，室温避光孵育30±15min；离心；弃上清，用coupling buffer洗涤，每次100-300μl，离心；加入任一终浓度50-200μg/ml的所述天然的或基因工程抗原中250μl，混匀，室温避光反应1-3hr；离心，弃上清；用wash buffer洗1-3次，12000rpm，4min离心；加入blocking buffer 200μl，多色微球终浓度为2000-2500个/μl，室温，摇床摇30±15min；离心，弃上清；得到天然的或基因工程抗原包被于不同的偶联羟基微球；和/或(2)包被合成多肽取出0.1-0.4ml偶联亲和素的多色微球放入Ep管中；加入任一等体积的storage buffer稀释的终浓度为8-12μg/ml的上述合成多肽)，4℃避光过夜；离心，弃上清；用洗脱缓冲液洗1-5次，离心，；加入storage buffer 200-500μl，多色微球终浓度为1200-1500个/μl；得到多肽包被的偶联有亲和素的微球。本专利技术所述的检测多种抗EB病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒，涉及39种抗原，其中，包括2种天然成分，即EB病毒总抗原裂解物和壳抗原VCA；5种基因工程抗原，EA-D(即系列表中NO.33)、EBNA-1全长(即系列表中NO.37)、EBNA-1片段(即系列表中NO.34)、p18(即系列表中NO.35)、p23(即系列表中NO.36)；32种合成多肽，包括碱性DNA酶2条、胸腺激酶2条、DNA聚合酶2条、Zebra(BZLF1)2条、Gp350/220(BLLF1)、P54/47(BMRF1)、EBNA1(BKRF1)、gp110/gp125(BALF4)、P18(BFRF3)、gN(BLRF1)、EBNA2(BYRF1)、EBNA-3a(BLRF3)、EBNA-3c(BERF3)、EBNA-LP、核糖核酸还原酶(BORF2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测多种抗ＥＢ病毒抗原抗体的液相芯片试剂盒，其特征是，主要包括有：至少一种包被有合成多肽的偶联亲和素的多色微球，和／或至少一种以上包被有天然的和／或基因工程抗原的偶联羟基多色微球；其中，天然抗原是ＥＢ病毒总抗原裂解物或壳抗原ＶＣＡ；基因工程抗原是系列表中ＮＯ．３３～ＮＯ．３７中的任一种的氨基酸系列；所述合成多肽是具有系列表中ＮＯ．１～ＮＯ．３２中任一种的氨基酸系列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾益新，谷爱娣，谢彦博，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]