一种直接针对互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于食品安全免疫检测技术领域，具体公开了一种互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。所述互隔交链孢酚半抗原具有如式（Ⅰ）所示的结构：其中，n=1，2。所述互隔交链孢酚人工抗原具有如式（Ⅲ）所示结构：其中，n=1，2；载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清蛋白或卵血清蛋白。利用本发明专利技术的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达1:128000，最低检测限为1.15ng/mL，半抑制浓度为16.5ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏度好、准确度高等显著优点，因此本发明专利技术提供的抗原和抗体，可用于建立互隔交链孢酚的酶联免疫吸附分析技术，从而用于快速检测食品中残留的互隔交链孢酚，具有广阔的应用前景。

Hapten, artificial antigen and antibody directed to cross chain phenol, preparation method and application thereof

The invention belongs to the technical field of food safety immunity detection, in particular to a hapten, artificial antigen and antibody of the invention, and a preparation method and an application thereof. The cross linked hapten has a structure as shown in formula (I), wherein, n=1, 2. The artificial antigen of the cross chain of Alternaria has the structure as shown in formula (III): n=1, 2; the carrier protein is keyhole hemocyanin, bovine serum albumin or egg albumin. The antiserum obtained by artificial antigen immune animal of the invention the titer was 1:128000, the minimum detection limit is 1.15ng/mL, half inhibitory concentration 16.5ng/mL, the antibody has high specificity and good sensitivity, high accuracy advantages, so the invention provides the antigen and antibody, can establish alternariol enzyme used for ELISA analysis technology, which can be used for rapid detection of food residue in alternariol, has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品安全免疫检测
，更具体地，涉及一种互隔交链孢酚的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。
技术介绍
互隔交链孢酚（(Altemariol,AOH)是一类具有诱变性、致癌性、基因毒性等多种毒性的小分子化合物，与互隔交链孢酚单甲醚（(Altemariolmethylether,AME）同属于二苯吡喃酮类衍生物，是链格孢霉次级代谢产物的毒素之一。K.Wollenhaupt等研究了AOH对猪子宫内膜细胞活性的影响，当AOH的添加量为12.5μmol/L时，子宫内膜细胞数量明显减少；当AOH的浓度为3.12μmol/L，细胞的代谢活性到显著影响；Pollock等研究了AOH及AME的亚急性毒性和致畸作用，当用200mg/kg的浓度注射怀孕8d的黄金仓鼠时，胎鼠平均体重下降，脏器严重坏死，且可观察到AOH与AME存在协同作用。Zhen等研究表明，AOH能够引起胚胎食道鳞状细胞癌变，从而引发食道癌。链格孢霉广泛的存在自然界中，AOH和AME作为其分较广和产量较高的两种毒素，主要存在于霉变腐烂的谷物、水果及蔬菜中。据报道，在我国食道癌、大骨节病高发病区的粮食真菌调查中，互隔交链孢霉广泛的存在于病区的粮食中；StinsonEE，ScottPM，LauBPY等分别检测了苹果及其饮料制品中的AOH残留情况，其检出率分别为1/22，17/32，11/11，含量分别为160μg/kg，1.35～5.42μg/kg，0.04～2.40μg/kg；此外橘汁、葡萄汁、无花果干等水果制品中也被检测出互隔交链孢酚。因此，建立快速、简便、灵敏的互隔交链孢酚毒素检测方法尤为重要。目前，国内外尚未制定互隔交链孢酚毒素在农作物及食品中的限量标准，其有关免疫检测方法的报道也鲜有见闻，而传统的检测方法如气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联和毛细管电泳等不仅费时费力，且操作要求高，不适宜大批量的快速筛选，因此，亟需专利技术一种针对互隔交链孢酚毒素的快速、简便的检测方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中互隔交链孢酚检测的不足，提供了一种互隔交链孢酚的半抗原及其相应的人工抗原和抗体。本专利技术的另一目的在于提供所述半抗原、人工抗原和抗体的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种直接检测互隔交链孢酚的免疫分析方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。一种互隔交链孢酚的半抗原，具有如式（Ⅰ）所示的结构：式（Ⅰ）中n=1，2。本专利技术最大限度的保留了互隔交链孢酚的空间结构，其半抗原只是在原有分子的基础上衍生出带2～3个C原子的羧酸分子手臂，与现有技术相比，本专利技术的抗原进行动物免疫后得到更优质、高效的抗体。由于互隔交链孢酚本身的合成难度较大，有关于其半抗原及人工抗原合成也鲜有报道，与其相关免疫检测方法也较少，而现有的互隔交链孢酚检测技术主要以仪器法为主，而仪器法操作复杂，前处理要求高，成本高。利用本专利技术的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达12.8k，最低检测限为1.15ng/mL，半抑制浓度为16.5ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏度好、准确度高等显著优点。优选地，式（Ⅰ）中所述n为1。一种互隔交链孢酚的人工抗原，具有如式（Ⅲ）所示结构：式（Ⅲ）中n=1，2；载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清蛋白或卵血清蛋白。所述半抗原式（Ⅰ）的制备方法，包括如下步骤：将互隔交链孢酚与具有式（Ⅱ）所示分子式结构的溴代羧酸酯类化合物反应后在碱性条件下水解得到具有式（Ⅰ）所示分子结构的互隔交链孢酚半抗原：。优选地，所述半抗原式（Ⅰ）的制备方法，包括如下步骤：S1.将互隔交链孢酚与具有式（Ⅱ）所示分子式结构的溴代羧酸盐按摩尔比1:1.5溶于适量DMF中；S2.加入与溴代羧酸酯等摩尔数的碳酸钾，常温反应3～5h；S3.加入适量1M的盐酸终止反应，过滤反应混合物得到白色沉淀，滤液用二氯甲烷萃取3次；S4.将S3的白色沉淀溶于二氯甲烷中，与萃取溶液合并后过硅胶柱，用体积比为1:5乙酸乙酯/正己烷洗脱液洗脱，收集洗脱液38℃旋干，得到白色粉末状物质；S5.上述白色粉末状物质溶于溶液体积比为1：1四氢呋喃/蒸馏水中，加适量LiOH，于碱性条件下水解12h；S6.用1M的盐酸终止反应，乙酸乙酯萃取，萃取液旋干后过硅胶柱，甲醇：氯仿：冰乙酸=1:30:0.01洗脱，最后蒸干的棕黄色粉末即为互隔交链孢酚半抗原。所述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将所述的互隔交链孢酚半抗原溶于DMF中，搅拌加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，然后再加入载体蛋白，4℃下搅拌反应过夜；偶联混合物于4℃下生理盐水透析2天得到目标产物；所述半抗原与载体蛋白的摩尔比为100～25:1。所述互隔交链孢酚人工抗原的制备方法为活泼酯法，优选地，包括如下步骤：S1.将5mg的互隔交链孢酚半抗原溶解于0.3mL二甲基亚砜（DMSO）；S2.在S1得到的溶液中分别加入1.5倍于互隔交链孢酚半抗原摩尔质量的DCC（N，N-二环己基碳二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），室温避光反应过夜；S3.将载体蛋白（12.3mgBSA、10mgOVA）分别溶于6mL的0.01MPBS的缓冲液中，再加入S1得到的溶液，并于4℃反应过夜；S4.S3溶液反应完成后，用生理盐水透析，得到无色互隔交链孢酚人工抗原。优选地，所述PBS缓冲液的pH值为7.4～8.0。优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白或卵血清蛋白。所述人工抗原制备得到的抗体，包括单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。所述人工抗原或所述抗体在互隔交链孢酚免疫检测分析中的应用。本专利技术还提供一种直接检测互隔交链孢酚的免疫分析方法，包括如下步骤：S1.将所述的互隔交链孢酚人工抗原免疫动物制备互隔交链孢酚的多克隆抗体；S2.将所述的互隔交链孢酚人工抗原作为包被原包被在微孔板上，将步骤S1制备得到互隔交链孢酚的多克隆抗体加入微孔板中；S3.加入待测样品，采用竞争ELISA测定待测样品中互隔交链孢酚的含量。与现有技术相比，本专利技术有益效果在于：利用本专利技术的人工抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达1:128000，最低检测限为1.15ng/mL，半抑制浓度为16.5ng/mL，所述抗体具有特异性高、灵敏度好、准确度高等显著优点，因此本专利技术提供的抗原和抗体，可用于建立互隔交链孢酚的酶联免疫吸附分析技术，从而用于快速检测食品中残留的互隔交链孢酚，具有广阔的应用前景。附图说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种互隔交链孢酚半抗原，其特征在于，具有如式（Ⅰ）所示的结构：式（Ⅰ）中n=1，2。

【技术特征摘要】
1.一种互隔交链孢酚半抗原，其特征在于，具有如式（Ⅰ）所示的结构：
式（Ⅰ）中n=1，2。
2.基于权利要求1的一种互隔交链孢酚人工抗原，其特征在于，具有如式（Ⅲ）所示结
构：
式（Ⅲ）中n=1，2；载体蛋白为钥孔血蓝蛋白、牛血清蛋白或卵血清蛋白。
3.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将互隔交链孢酚与
具有式（Ⅱ）所示分子式结构的溴代羧酸酯类化合物反应后在碱性条件下水解得到具有式
（Ⅰ）所示分子结构的互隔交链孢酚半抗原：
。
4.根据权利要求3所述半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将互隔交链孢酚与具有式（Ⅱ）所示分子式结构的溴代羧酸盐按摩尔比1:1.5于适
量DMF中；
S2.加入与溴代羧酸酯等摩尔数的碳酸钾，常温反应3～5h；
S3.加入适量1M的盐酸终止反应，过滤反应混合物得到白色沉淀，滤液用二氯甲烷萃
取3次；
S4.将S3的白色沉淀溶于二氯甲烷中，与萃取溶液合并后过硅胶柱，用体积比为1:5乙
酸乙酯/正己烷洗脱液洗脱，收集洗脱液38℃旋干，得到白色粉末状物质；
S5.上述白色粉末状物质溶于溶液体积比为1：1四氢呋喃/蒸馏水中，加适量LiOH，于
碱性条件下水解12h；
S6.用1M的盐酸终止反应，乙酸乙酯萃取，萃取液旋干后过硅胶柱，甲醇：氯仿：冰乙酸
=1:30:0.01洗脱，最后蒸干的棕黄色粉末即为互隔交链孢酚半抗原。
5.权利要求2所述人工抗原的制备方法，其特征在于，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，朱帆，王弘，杨金易，徐振林，肖治理，孙远明，雷红涛，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44