一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，将活化的磁珠和小分子半抗原或种属间高度保守抗原按一定比例在反应体系下充分混合，进行偶联反应，通过免疫小鼠，获得单克隆抗体。本发明专利技术降低了种属间高度保守抗原抗体制备的成本，简化了小分子半抗原抗体制备的工艺，提供了一种广泛适用的抗原制备方法，使种属间高度保守的抗原及小分子量半抗原在小鼠体内产生较好的免疫反应，从而筛选出高亲和力、高特异性的抗体。

Method for preparing highly conserved antigen between species and small molecule hapten antibody

The invention discloses a method for preparing a highly conserved antigen and small molecular hapten antibody, activated beads and small molecular hapten or species highly conserved antigen according to a certain proportion in the reaction system of mixing, coupling reaction, obtained by immunizing mice with monoclonal antibody. The invention reduces the species of highly conserved antigen antibody preparation cost, simplifies the process of small molecular hapten antibody preparation, provides a widely applicable method of antigen preparation, the species of highly conserved antigen and small molecular hapten produced a good immune response in mice, and screening of high affinity antibody and high specificity.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备抗体的方法，具体涉及一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，属于生物工程
技术背景免疫分析是建立在抗原和抗体的特异性、可逆性结合反应基础上的高效分析技术。继Yelow等人于1959年首次创立放射性免疫分析方法在痕量分析中取得重大突破，酶免疫分析法、荧光免疫分析法和化学发光免疫分析法等免疫学分析方法相继发展起来，并凭借其检测迅速、样品通量大、灵敏性高、特异性强、成本低廉等特点，在药物残留分析、分子标志物检测、疾病筛查、环境污染物检测等领域得到了广泛的应用。作为各种免疫分析的核心试剂，抗体在免疫分析的特异性、灵敏度等指标中起着决定性的作用。因此，制备高亲和力抗体是建立免疫分析方法的关键环节。许多分子标记物、药物、毒素的分子量小于1000Da，属于仅有反应原性而无免疫原性的半抗原，难以通过常规的动物免疫制备抗体。目前，制备小分子半抗原抗体的一般方法是：通过共价键使半抗原与大分子质量蛋白质载体偶联，制备人工免疫原，经动物免疫程序制备特异性抗体。其中，涉及半抗原的设计，连接臂的引入及活性基团的选择等多个技术环节，工艺复杂。此外，有许多疾病筛查的关键分子在种属间的同源性较高，而对于同源性大于75%的蛋白，由于小鼠对自身蛋白的免疫耐受，一般需免疫相应的基因敲除鼠才能得到相应的抗体，而针对某一蛋白构建相应的基因敲除鼠工程复杂、成本高昂。因此，迫切需要一种广泛适用的抗原制备方法，使种属间高度保守的抗原及小分子量半抗原在小鼠中产生较好的免疫反应，从而筛选出高亲和力、高特异性的抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，其工艺简单、操作方便。本专利技术的目的是这样实现的，一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法。具体的，本专利技术的一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，包括以下步骤：（1）抗原溶液制备取适量抗原，即小分子半抗原或种属间高度保守抗原，用中性缓冲盐溶液溶解，配制成浓度为0.1～3.0mg/ml的抗原溶液，置于4℃保存；（2）抗原与磁珠偶联取适量抗原溶液与等体积磁珠在EP管中混合，涡旋15s，置于垂直混合仪上，室温混合1～2小时，每隔15min，取下EP管，涡旋15s，采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；（3）封闭磁珠加入浓度为0.15mol/LNaCl溶液于前述EP管中，涡旋30s，置于垂直混悬仪中室温反应2小时，采用磁性分离架富集磁珠，弃上清；（4）在前述EP管中加入适量流穿液重新悬浮磁珠，再加入等体积免疫佐剂，充分混合，得到磁珠偶联抗原与佐剂混合物；（5）将前述得到的磁珠偶联抗原与佐剂混合物免疫动物；（6）经多轮筛选出反应阳性的细胞克隆，作为生产抗体的杂交瘤细胞株；（7）在小鼠体内接种杂交瘤细胞获得腹水抗体，将腹水进行纯化，得到鼠来源的单克隆抗体。本专利技术中所述的小分子半抗原是指分子量小于1000Da且具有伯胺基团的化合物。本专利技术中所述的种属间高度保守抗原是指与免疫动物自身蛋白具有75%以上氨基酸序列相同的异源蛋白。本专利技术所述的磁珠是表面含有NHS基团的磁珠，与传统的氨基、羧基磁珠相比，表面含有NHS基团的磁珠无需事先采用EDC/NHS或戊二醛进行活化。本专利技术将含有伯氨基的生物配体溶解在中性盐缓冲液中，室温下将化合物与NHS磁珠混合1～2小时，完成配体和磁珠的共价偶联，偶联过程条件温和，操作简单。本专利技术使用磁性分离架实现磁珠与溶剂分离，不再依赖柱层析、离子层析，简化了传统偶联方法中分离纯化步骤。本专利技术取得的有益效果如下：本专利技术降低了种属间高度保守抗原抗体制备的成本，简化了小分子半抗原抗体制备的工艺，提供了一种广泛适用的抗原制备方法，使种属间高度保守的抗原及小分子量半抗原通过免疫动物的方法，筛选并获得高亲和力、高特异性的抗体。附图说明图1是点杂交检测图，其中A是普通细胞培养上清与m6A结合的点；B是杂交瘤细胞培养上清与m6A结合的点。图2是WesternBlot检测图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，以下对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术，但是本专利技术还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似推广，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本专利技术至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。实施例1m6A抗体制备m6A的分子量只有281Da，是典型的半抗原，在抗体制备过程中，直接给小鼠注射m6A分子溶液，不能引起小鼠机体的免疫反应，本实施例中通过与磁珠偶联提高m6A的免疫原性。（1）m6A与磁珠偶联物的制备取2.5mg抗原m6A用0.5ml中性缓冲盐溶液溶解，配制成浓度为5.0mg/ml的抗原溶液，与等体积磁珠混合，涡旋15s，置于垂直混合仪上，室温混合1~2小时，每隔15min，取下EP管，涡旋5s。采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液。加入1mL的0.15MNaCl溶液于EP管中，涡旋30s，置于垂直混悬仪中室温反应2小时。采用磁性分离架富集磁珠，弃上清。在EP管中加入0.5ml流穿液重新悬浮磁珠，并与等体积的免疫佐剂充分混合，置于4℃保存。（2）免疫动物本专利技术所用免疫动物为BALB/c小鼠，免疫佐剂为KX0210041，购自北京博奥龙免疫技术有限公司。1）腿部肌肉注射免疫BABL/C小鼠（200ul/只）。2）每隔一个月进行重复免疫，免疫三次。（3）单克隆抗体的制备和纯化将成功获得的抗原混合免疫鼠龄为8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，将3只小鼠的脾脏混合进行融合。免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。具体方法如下：1）将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。2）ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100%，即认为此为单克隆。即通常认为的建株成功的细胞株。3）将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1-2×106/管进行冻存。同时收集细胞安排腹水制备。4）细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10-14天收集腹水，ELISA检测腹水是否制备成功。5）腹水完成后采用ProteinG柱纯化腹水。（4）单克隆抗体的点杂交检测分别将m6A核苷溶液溶液点样于硝酸纤维素膜上，待溶液吸干，加封闭液于室温封闭至少1h；PBST洗液洗膜5次，用所制备的单克隆抗体作为一抗，用普通小鼠血清作为阴性对照，4℃孵育过夜。孵育结束后用PBST洗液洗膜5次，抗体稀释液稀释HRP标记的抗小鼠二抗，孵育1h，PBST洗液洗膜5次本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）抗原溶液制备取适量种属间高度保守抗原或小分子半抗原，用中性缓冲盐溶液溶解，配制成浓度为0.1～3.0 mg/ml的抗原溶液，置于4℃保存；（2）抗原与磁珠偶联取适量前述抗原溶液与等体积磁珠在EP管中混合，涡旋15s，置于垂直混合仪上，室温混合1～2小时，每隔15min，取下EP管，涡旋15s，采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；（3）封闭磁珠加入浓度为0.15mol/L NaCl溶液于前述EP管中，涡旋30s，置于垂直混悬仪中室温反应2小时，采用磁性分离架富集磁珠，弃上清；（4）在前述EP管中加入适量流穿液重新悬浮磁珠，再加入等体积免疫佐剂，充分混合，获得磁珠偶联抗原与佐剂的混合物；（5）将前述获得的磁珠偶联抗原与佐剂混合物免疫动物；（6）经多轮筛选出反应阳性的细胞克隆，作为生产抗体的杂交瘤细胞株；（7）在小鼠体内接种杂交瘤细胞获得腹水抗体，将腹水进行纯化，得到鼠来源的单克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种制备种属间高度保守抗原及小分子半抗原抗体的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）抗原溶液制备取适量种属间高度保守抗原或小分子半抗原，用中性缓冲盐溶液溶解，配制成浓度为0.1～3.0mg/ml的抗原溶液，置于4℃保存；（2）抗原与磁珠偶联取适量前述抗原溶液与等体积磁珠在EP管中混合，涡旋15s，置于垂直混合仪上，室温混合1～2小时，每隔15min，取下EP管，涡旋15s，采用磁性分离架富集磁珠，保存流穿液；（3）封闭磁珠加入浓度为0.15mol/LNaCl溶液于前述EP管中，涡旋30s，置于垂直混悬仪中室温反应2小时，采用磁性分离架富集磁珠，弃上清；（4）在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，张东明，李丹丹，
申请(专利权)人：河北意和医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13