鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体及其制备方法，该二价蛋黄抗体包含鸭病毒性肝炎DHAV‑1型和鸭病毒性肝炎DHAV‑3型蛋黄抗体，该制备方法包括：(1)采用鸭病毒性肝炎DHAV‑1型毒株和DHAV‑3型毒株分别接种SPF鸡胚和易感鸭胚，然后收获尿囊液，将该收获的病毒液按比例混合，甲醛灭活并制备疫苗；(2)使用该疫苗免疫产蛋鸡，免疫后抽样测定鸡高免蛋黄中抗DHAV‑1型、DHAV‑3型抗原抗体中和效价≥1∶8192，之后收集该鸡的高免蛋；(3)将该高免蛋蛋壳消毒，收集蛋黄后加入等体积蒸馏水，搅拌混匀，低温巴氏灭活；酸化蒸馏水法提纯、辛酸法提纯；微滤，超滤。本发明专利技术提供的二价蛋黄抗体，成本低，效价高，可对DHAV‑1和DHAV‑3引起的鸭病毒性肝炎做到有效的控制，可获得显著的社会效益。

【技术实现步骤摘要】
鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体及其制备方法和应用本申请为专利申请201210530208.5的分案申请，原案专利技术名称为“鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体及其制备方法和应用”，申请日为2012年12月11日。
本专利技术涉及一种高免疫蛋黄抗体，具体地说，涉及一种鸭病毒性肝炎的蛋黄抗体。
技术介绍
鸭病毒性肝炎(DuckVirusHepatitis，DVH)是由小RNA病毒科肠病毒属的鸭肝炎病毒(DuckHepatitisVirus，DHV)引起雏鸭的一种急性、高度致死性、烈性传染病。本病常年发生，自然状态下只感染3周龄内的雏鸭，常造成重大的经济损失，威胁着养鸭业的健康发展。世界动物卫生组织(OIE)将鸭病毒性肝炎划归为B类动物疾病。鸭肝炎病毒有历史上分为血清型Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，三者间没有抗原相关性。其中I型鸭病毒性肝炎呈世界性分布。II型鸭病毒性肝炎是1965年发现于英国，且自20世纪80年代中期暴发后，该地区也再未见该病的发生。III型1969年发现于美国纽约长岛地区。II型、III型目前已被重新分类为鸭星状病毒属成员，分别称为鸭星状病毒1型(duckastrovirus1，DAstV-1)、鸭星状病毒2型(DAstV-2)。2009年，国际病毒分类委员会(TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV)在小RNA病毒科中新成立禽肝病毒属(Avihepatovirus)，传统的血清I型鸭肝炎病毒属于其中的鸭甲型肝炎病毒(DHAV)，被称为DHAV-1，DHAV还包括另外两个血清型即DHAV-2、DHAV-3，DHAV-2和DHAV-3分别与DHAV-1无血清交叉中和作用。WangL等(2008)则按基因分型称之为A型(DHAV-A)、B型(DHAV-B)、C型(DHAV-C)。研究表明，根据衣壳蛋白编码序列所区分的基因型与采用中和试验所区分的血清型存在对应关系。国内外学者就DHV血清型的流行状况开展了研究。2007年，Tseng从1989-1990年台湾地区暴发鸭病毒性肝炎的病鸭体内分离病原，通过中和试验证明是一株新型鸭肝炎病毒，N-DHV(可称作DHAV-2)，目前仅发现于台湾地区。2007年，韩国Kim等从2003年和2004年暴发鸭病毒性肝炎的病鸭体内分离到一株病毒，与DHV-Ⅰ的血清型不同，称为DHV-AP(又称作DHAV-3)。以往在我国流行的主要是I型鸭肝炎病毒，采用传统的弱毒疫苗和高免蛋黄抗体进行I型DHV的预防和治疗。但近几年来，不断有使用I型鸭肝炎弱毒疫苗或高免蛋黄抗体进行预防或治疗无效的鸭群爆发疑似鸭肝炎，怀疑为新型鸭肝炎。而近年来，韩国新型(DHAV-3)在我国的地区分布已较为广泛。苏敬良等(新型DHV的分离及初步鉴定，中国兽医科技，2002，32(1)：15～16)经过病原分离鉴定和鸭胚血清中和试验，分离到与DHV-I、DHV-III无血清学交叉免疫反应的小RNA病毒，称为新型鸭肝炎病毒；黄安国等(新型鸭肝炎病毒的分离与初步鉴定，广西畜牧兽医，2003，19(5)：198～199)也从以I型鸭病毒性肝炎高免蛋黄抗体或I型鸭肝炎弱毒疫苗不能治愈或预防的类似I型鸭病毒性肝炎的发病鸭群中分离到新型鸭肝炎病毒。随后刘建等(新型DHV流行病学调查及免疫防治试验，中国兽医杂志，2006，42(2)：3～6)从北京、河北、山东和广西等地送检并具有明显的肝脏出血病变特征的雏鸭肝脏中分离到9株病毒株，通过对其进行血清学鉴定，发现其中7株为新型鸭肝炎病毒，2株为I型鸭肝炎病毒。这些研究结果就可以揭示近年来不少地区雏鸭在发生鸭病毒性肝炎后注射高免血清或高免蛋黄抗体治疗无效的原因。研究结果已显示我国多个地区同时流行DHAV-1和DHAV-3，且两者间缺乏交叉保护，对DHAV-3所引起的DVH还缺乏有效的控制措施。
技术实现思路
为了满足生产上对DVH有效防治技术的迫切需求，及时控制国内DVH的发生，本专利技术利用传统的I型(DHAV-1)鸭肝炎病毒与新型(DHAV-3)鸭肝炎病毒制备了二价蛋黄抗体。为此，本专利技术提供了一种鸭病毒性肝炎病毒株，所述病毒株VP1基因编码氨基酸的序列包含如图六所示的具有49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点。优选地，所述鸭病毒性肝炎病毒株为鸭病毒性肝炎病毒SD1株，所述SD1株保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.V201225，保藏地址为中国武汉·武汉大学。本专利技术提供了一种DNA序列，它实质上含有seqNo.1的核苷酸序列，本专利技术中的术语“实质上含有”是指本专利技术的核苷酸序列在保持其功能的范围内，序列号1碱基序列可以发生置换、插入或缺失等变异。本专利技术提供了一种VP1抗原蛋白，所述的VP1抗原蛋白包含如图六所示的具有49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点的鸭病毒性肝炎病毒VP1共有序列。本专利技术的主要目的在于提供一种鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，所述二价蛋黄抗体包含鸭病毒性肝炎DHAV-1型和鸭病毒性肝炎DHAV-3型蛋黄抗体。所述抗体效价高且成本较低，能够有效控制目前国内流行的不同血清型的鸭病毒性肝炎。本专利技术另一目的在于提供一种鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体的制备方法，所述方法安全、易于使用，所述制备方法包括：(1)采用鸭病毒性肝炎DHAV-1型毒株和DHAV-3型毒株分别接种9日龄SPF鸡胚和10日龄易感鸭胚，然后收获尿囊液，将所述收获的病毒液按比例混合，甲醛灭活并制备疫苗；(2)使用所述制备的疫苗免疫产蛋鸡，免疫后抽样测定鸡高免蛋黄中抗DHAV-1型、DHAV-3型抗原抗体中和效价≥1∶8192，之后收集所述鸡的高免蛋；(3)将所述高免蛋蛋壳消毒，收集蛋黄，所述蛋黄加入等体积蒸馏水，搅拌混匀，低温巴氏灭活；酸化蒸馏水法提纯、辛酸法提纯；微滤，超滤。优选地，所述鸭病毒性肝炎DHAV-1型毒株为DRL-62株、所述DHAV-3型毒株为SD1。优选地，所述免疫程序为：所述产蛋鸡120日龄时肌肉注射1ml/只，14日后等剂量肌肉注射，所述二免10日后再用等剂量肌肉注射进行三免，所述三免后10日再用等剂量肌肉注射进行第四次强化免疫。优选地，所述低温巴氏灭活条件为62.5℃加热灭活30min；优选地，所述酸化蒸馏水法提纯步骤为：先在隔层反应罐中加入相当于所述蛋黄6倍体积的灭菌蒸馏水，所述蒸馏水pH值为4.2，并降温至4℃，然后，将灭活的所述蛋黄液加入，搅拌，4℃静置4h，离心分离上清液；所述辛酸法提纯步骤为：按所述上清液总量的0.2％体积加入辛酸，搅拌，室温放置4h，过滤至澄清，再按所述滤液总量的0.1％加入饱和甲醛溶液，搅拌，室温放置24h。优选地，所述微滤使用0.22μm微孔滤芯过滤除菌，所述超滤用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒。本专利技术再一目的在于提供了鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体在制备预防和治疗鸭病毒性肝炎的药物中的应用。本专利技术的还一目的在于提供了一种预防和治疗鸭病毒性肝炎的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的由VP1基因编码氨基酸基因序列包含如图六所示的具有49-T、196-N、207-E三个氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭病毒性肝炎病毒株，所述病毒株VP1基因编码氨基酸的序列包含如图六所示的具有49‑T、196‑N、207‑E三个氨基酸取代位点和197‑Q、198‑S、199‑D三个共有位点。

【技术特征摘要】
1.一种鸭病毒性肝炎病毒株，所述病毒株VP1基因编码氨基酸的序列包含如图六所示的具有49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点。2.根据权利要求1所述的鸭病毒性肝炎病毒，所述的鸭病毒性肝炎病毒为鸭病毒性肝炎病毒SD1株，所述SD1株保藏地址为中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.V201225。3.一种DNA序列，它为seqNo.1的核苷酸序列。4.一种VP1抗原蛋白，所述的VP1抗原蛋白为如图六所示的具有49-T、196-N、207-E三个氨基酸取代位点和197-Q、198-S、199-D三个共有位点的鸭病毒性肝炎病毒VP1共有序列。5.一种鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，其特征在于，所述二价蛋黄抗体包含鸭病毒性肝炎DHAV-1型和鸭病毒性肝炎DHAV-3型蛋黄抗体。6.一种鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体的制备方法，所述制备方法包括：(1)采用鸭病毒性肝炎DHAV-1型毒株和DHAV-3型毒株分别接种9日龄SPF鸡胚和10日龄易感鸭胚，然后收获尿囊液，将所述收获的病毒液按比例混合，甲醛灭活并制备疫苗；(2)使用所述制备的疫苗免疫产蛋鸡，免疫后抽样测定鸡高免蛋黄中抗DHAV-1型、DHAV-3型抗原抗体中和效价≥1∶8192，之后收集所述鸡的高免蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，白朝勇，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南,41