抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，通过基因工程手段，将合成M.Barkeri的(PylRS)的DNA与质粒pBK重组，获得PylRS-pBK；以PylRS-pBK为模板，构建突变库lib-PylRS-pBK；将lib-PylRS-pBK电击转化、筛选；筛选重组CoukRS-pBK质粒；将抗HBeAg抗体的DNA与pBAD重组，获得anti-HBeAg-4tag-pBAD；分别将质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD和CoukRS-pBK转化到感受态中，获得了制备抗乙肝e抗原绿色荧光抗体的生物表达系统。本发明专利技术实现了抗乙肝e抗原绿色荧光抗体的制备，提高了检测的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法。
技术介绍
乙肝病毒(HBV)慢性感染是导致肝纤维化、肝硬化和肝癌的主要原因，每年有近100万人死于HBV慢性感染引起的肝硬化或肝癌等疾病。目前中国有近1亿HBV慢性感染人群，每年仍有10万例新发HBV感染者。乙肝e抗原的定量是医生判断病情和指导治疗的重要依据。受技术所限，乙肝e抗原的检测一直处于手工定性或者半定量状态。最近，国外的公司有通过化学显色的方法来定量乙肝e抗原，然而化学显色方法灵敏度低，检测不到血液中低丰度的乙肝e抗原，会给乙肝e抗原的检测带来误判。荧光发光检测的方法灵敏度高，可以检测到样本中单个拷贝的靶标。基于此，有必要设计一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，用来大幅度提高乙肝e抗原检测的灵敏度，实现乙肝e抗原的精确定量检测，辅助加强对乙型肝炎的发病的监控力度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，旨在提高乙肝e抗原的检测灵敏度、性质稳定性和特异性，适用于乙肝e抗原的精确定量检测。为实现上述目的，本专利技术提供一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，所述抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：S1：获得M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK；S2：获得7-羟基香豆素赖氨酸；S3：筛选CouKRS-pBK质粒，该质粒中包含特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体CouKRS的基因序列coukrs；S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；S5：将步骤S3中的CouKRS-pBK质粒和步骤S4中的anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对菌株A进行培养、离心、超声破碎以及色谱柱纯化得到抗乙肝e抗原绿色荧光抗体。优选地，所述步骤S1包括如下步骤：S101：人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列；S102：将上述合成的M.BarkeriPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，获得重组质粒PylRS-pBK；S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L274NNK、引物r-L274NNK、引物f-L270NNK、引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；S104：以所述重组质粒PylRS-pBK为模板，以所述引物f-L274NNK和引物r-L274NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270NNK和引物r-L270NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预设比例混合，获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK。优选地，所述第二预设比例为1:1:32:1。优选地，所述步骤S2包括如下步骤：S201：取第一预设量的间苯二酚，溶于水中，并加热到90℃，滴加第二预设量的苹果酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素A；S202：取第三预设量的上述7-羟基香豆素A、赖氨酸和Licl水溶液于60℃搅拌，经过12小时；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到7-羟基香豆素母液C。优选地，所述7-羟基香豆素母液C经过0.22微米滤膜过滤除菌。优选地，所述7-羟基香豆素母液C的浓度设定为100mM。优选地，所述第一预设比例为1:1。优选地，所述特定的物质为7-羟基香豆素母液C，卡那霉素，四环素，L-阿拉伯糖组成的混合物。优选地，所述步骤S6包括如下步骤：S601：将步骤S5获得的菌株A接种于LB液体培养基中，并置于37℃摇床中培养12小时，获得扩增用的菌种母液B；S602：将所述菌种母液B按照1:100的体积比，接种于体积为1L的LB液体培养基中，37℃摇床培养2小时，获得培养液C；S603:在所述培养液C中，添加7-羟基香豆素母液C，卡那霉素，四环素，L-阿拉伯糖10mL37摄氏度，200转速，培养7小时，获得培养液D；S604:取所述培养液D，分别置于离心管中离心，获得大肠杆菌沉淀组1；S605：将所述大肠杆菌沉淀组1加入无菌水，漩涡震荡重悬，获得大肠杆菌沉淀组2；S606：将所述大肠杆菌沉淀组2分别置于-80℃的冰箱，30min后取出，室温下融化；S607:将S606中融化的大肠杆菌沉淀组2中，加超声缓冲液；置于超声破碎仪上进行破碎，离心，获得大肠杆菌沉淀组2相应的上清液组1；S608:将所述上清液组1经镍离子亲和柱，分离纯化，获得抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体。优选地，所述超声破碎仪的功率为25瓦，工作时间为5秒，间歇时间为10秒，工作环境为4摄氏度。本专利技术提供的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法通过合成M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上获得PylRS-pBK；通过“一步饱和突变”的方法，构建PylRS酶活力中心的突变库lib-PylRS-pBK；将lib-PylRS-pBK电击转化至包含有筛选质粒pREP的筛选Top10感受态中，制备筛选用大肠杆菌；合成香豆素赖氨酸；筛选重组了特异识别香豆素赖氨酸的氨酰-tRNA合成酶突变体CoukRS的CoukRS-pBK质粒；通过基因工程手段，将抗HBeAg抗体anti-HBeAg的DNA序列与质粒pBAD重组，获得anti-HBeAg-4tag-pBAD；通过转化的方法，将anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒和CoukRS-pBK质粒转化Top10感受态中，获得了制备抗乙肝e抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：S1：获得M.Barkeri PylRS突变库lib‑PylRS‑pBK；S2：获得7‑羟基香豆素赖氨酸；S3：筛选获得CouKRS‑pBK质粒，该质粒包括能够特异识别7‑羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰‑tRNA合成酶突变体CouKRS的基因序列coukrs；S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti‑HBeAg‑4tag‑pBAD；S5：将步骤S3中的CouKRS‑pBK质粒和步骤S4中的anti‑HBeAg‑4tag‑pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对菌株A进行培养、离心、超声破碎以及色谱柱纯化得到抗乙肝e抗原绿色荧光抗体。

【技术特征摘要】
1.一种抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特征在于，所述抗
乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法包括如下步骤：
S1：获得M.BarkeriPylRS突变库lib-PylRS-pBK；
S2：获得7-羟基香豆素赖氨酸；
S3：筛选获得CouKRS-pBK质粒，该质粒包括能够特异识别7-羟基香豆
素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体CouKRS的基因序列coukrs；
S4：合成抗乙肝e抗原抗体的DNA序列，将所述抗乙肝e抗原抗体的
DNA序列与质粒pBAD重组，获得大肠杆菌表达质粒anti-HBeAg-4tag-pBAD；
S5：将步骤S3中的CouKRS-pBK质粒和步骤S4中的
anti-HBeAg-4tag-pBAD质粒按照第一预设比例混合，经过电击转化，导入到
大肠杆菌Top10中，经抗性筛选，获得菌株A；
S6：将步骤S5获得的菌株A接种培养，在培养基中添加特定的物质，对
菌株A进行培养、离心、超声破碎以及色谱柱纯化得到抗乙肝e抗原绿色荧
光抗体。
2.如权利要求1所述的抗乙肝e抗原的绿色荧光抗体的制备方法，其特
征在于，所述步骤S1包括如下步骤：
S101：人工合成M.BarkeriPylRS的DNA序列；
S102：将上述合成的M.BarkeriPylRS的DNA序列连接到pBK质粒上，
获得重组质粒PylRS-pBK；
S103：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-L274NNK、引
物r-L274NNK、引物f-L270NNK、引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK、
引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；
S104：以所述重组质粒PylRS-pBK为模板，以所述引物f-L274NNK和引
物r-L274NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；
S105：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270NNK和引物r-L270NNK
为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；
S106：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物

\tr-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；
S107：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK
为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；
S108：所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照第二预设比例
混合，获得用于7-羟基香豆素筛选用的M.BarkeriPylRS突变库
lib-PylRS-pBK...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贯京，陈兴明，张少鹏，高伟明，李慧玲，潘延超，
申请(专利权)人：深圳市贝沃德克生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44