本发明专利技术提供TRPC5的阻断型抗体T5E3的一种新用途，即：TRPC5的阻断型抗体T5E3在逆转肿瘤多药耐药中的应用，所述阻断型抗体的制备方法为：以人工合成或基因表达获得的E3肽段作为抗原并免疫动物制得，所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。本发明专利技术的重要之处是发现了TRPC5与肿瘤多药耐药密切相关，能间接上调介导肿瘤产生多药耐药的P-gp蛋白在多药耐药肿瘤细胞中的表达水平，以及TRPC5阻断型抗体T5E3对体内外肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，且对实验动物无毒副作用，因此，本发明专利技术为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路，本发明专利技术阻断型抗体T5E3是一种具有良好开发前景的肿瘤多药耐药逆转剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及TRPC5的阻断型抗体T5E3的ー种新用途，尤其涉及TRPC5的阻断型抗体T5E3在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
技术介绍
肿瘤多药耐药(multidrug resistance, MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同吋，对结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性，从而大大降低抗肿瘤药物的疗效。跨膜蛋白介导的MDR为最经典的MDR产生机制，其中最常见的为P-糖蛋白。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)也称pl70糖蛋白，是由多药耐药基因MDRl所编码的ー种ATP依赖性膜转运蛋白，P-gp为ー种药物泵，能将多种药物泵出细胞外，使胞内药物聚积減少，从而减弱药物的细胞毒作用，使肿瘤细胞产生耐药性。P-gp主要介导亲脂性抗肿瘤药物引起的MDR，包括抗生素类如多柔比星/阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC),植物类药物如长春新碱(VCR)、依托泊苷(Vp216)等。随着对肿瘤多药耐药分子发生机制研究的不断深入，采用不同的手段和方法来克服肿瘤多药耐药已在试验和临床应用方面取得了很大进展，目前常采用的逆转策略包括以下几种 (I)化学药物治疗 化学药物逆转剂的应用是目前临床上治疗肿瘤多药耐药的主要手段，包括第一代逆转剂维拉帕米和环保菌素A,第二代逆转剂dex-维拉帕米、valsodar (PSC833)、bricoda(VX-710),以及第三代逆转剂 Tariquidar (XR9576),Zosuquidar (LY335979),Laniquidar(R101933)。但这类逆转剂在临床上出现的剂量依赖性副作用严重限制了它们的应用。(2)天然药物治疗 天然药物具有资源丰富、低毒等优点，近年来研究已证实多种植物中草药具有逆转肿瘤多药耐药的功效，且逆转方式各有特点。但目前为止对于中药逆转剂的研究还主要集中在体外试验，尚无成熟的临床应用实践。(3)基因治疗 基因治疗是目前肿瘤治疗的新方法，其多药耐药基因的基因治疗靶点主要集中在MDRl基因和ー些肿瘤相关基因，反义核酸技术、核酶技术以及RNA干扰技术为多药耐药的逆转提供了新的高效特异的方法。然而目前基因治疗还很不成熟，要真正过渡到临床，尚有大量的工作要做。总之，目前肿瘤多药耐药仍是肿瘤临床治疗所面临的重大难题，寻找新的高效特异逆转肿瘤多药耐药的方法和途径亟不可待。TRPC5 是瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels, TRP 通道)家族的ー个亚型，它是细胞膜上能通透钙离子的非选择性通道，主要分布于脑、肺、睾丸和胎盘，并主要參与生长锥的形成和脑的发育。已有研究发现，设计一段能识别TRPC5三个胞外区域(third extracellular region ,E3)的多肽,将该多肽片段与一个大片段载体连接，免疫动物后获得的被称为T5E3的阻断型抗体能特异性阻断TRPC5的活性，已被广泛应用于TRPC5的功能性研究领域中。目前，国内外未见TRPC5的阻断型抗体T5E3在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供TRPC5的阻断型抗体T5E3的ー种新用途，即TRPC5的阻断型抗体T5E3在逆转肿瘤多药耐药中的应用。所述阻断型抗体T5E3的制备方法为用通过人工合成或基因表达方式获得的多肽作为免疫原免疫动物，免疫程序完毕后收集所述动物的血清，并按照常 规实验方法对所述血清中的抗体进行分离纯化后制得，所述多肽为位于TRPC5跨膜结构域的E3肽段，具有CYETRAIDEPNNCKG所示的氨基酸序列。所述肿瘤多药耐药是由P-gp介导产生。本专利技术的有益技术效果为 经本专利技术人研究发现，瞬时受体电位通道TRPC5与肿瘤多药耐药密切相关，能间接上调介导肿瘤产生多药耐药的P-gp蛋白在多药耐药肿瘤细胞(如MCF-7/ADM)中的表达水平；实验表明，TRPC5阻断型抗体T5E3对体内外肿瘤细胞的多药耐药具有明显的逆转作用，且对实验动物无毒副作用；因此，本专利技术为肿瘤多药耐药的逆转提供了新的思路，本专利技术阻断型抗体T5E3是ー种具有良好开发前景的高效低毒的肿瘤多药耐药逆转剂。附图说明图I为本专利技术实施例I中TRPC5阻断型抗体T5E3对多药耐药肿瘤细胞中P_gp表达下调作用的实验结果示意图。图2为本专利技术实施例2中TRPC5阻断型抗体T5E3对体外肿瘤细胞多药耐药的逆转作用的实验结果示意图。图3为本专利技术实施例3中TRPC5阻断型抗体T5E3对体内肿瘤细胞多药耐药的逆转作用的实验结果示意图。具体实施例方式以下结合附图，并通过实施例对本专利技术进行具体说明。实施例I 实施例3所使用实验材料如下 抗体TRPC5阻断型抗体T5E3由江南大学药物设计与分子药理学研究室制备并保存，其制备万法如又献(Xu SZ, et a_L. Generation of functional ion—channel tools byE3 targeting NatBiotechnol (2005) 23:1289 - 1293)所述人工合成 TRPC5 跨膜结构域的一段多肽(序列CYETRAIDEPNNCKG，该序列为TRPC5的一段功能性结构域，NP_036603. 1，E3肽段)，并将该肽段与血蓝蛋白(购自美国国际Alpha诊断公司)(keyhole limpethemocyanin,KLH)相连接,将0. 5mg连接后的肽段作为抗原注射于新西兰兔背部,于21天、42天后分别再注射一次，方法同前，四周后收集免疫后的兔血清，对该血清中的T5E3抗体进行提纯，先运用IgG纯化柱HiTrap protein G column (购自美国GE公司)粗提IgG,再运用交联E3肽链的树脂(购自美国Thermo公司)精提T5E3抗体；^ tubulin antibody(SC-9104)购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购自上海碧云天生物科技有限公司。细胞系野生型人乳腺癌细胞MCF-7/WT购自美国模式培养物寄存库(ATCC);耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM由江南大学药物设计与分子药理学研究室制备并保存，其制备方法如下将新复苏的野生型人乳腺癌细胞MCF-7/WT细胞(购自ATCC)于细胞培养常规条件下培养2代 3代，使细胞生长稳定，待细胞汇合时用胰酶进行消化并传代，第二天更新培养基，同时以MCF-7/WT IC50的1/10为起始浓度加入阿霉素，加药第二天后再次换液，并维持阿霉素的浓度进行常规传代培养，待细胞稳定生长后提高药物浓度继续培养，直到细胞可在阿霉素浓度为5 u g/ml的培养基中稳定生长，即得，整个制备过程历时8个月。实验动物耐药荷瘤小鼠，其制备方法如下取体外常规培养的MCF-7/ADM，待细胞汇集90%吋，收集细胞，按照每只小鼠5 X IO6个细胞的接种量接种雌性裸鼠(购自香港中文大学动物中心)背部，四周后开始成瘤。实验仪器酶标仪购自美国Bio-Rad公司；5%C02恒温细胞培养箱购自美国 Thermo公司；蛋白转印仪购自美国Bio-Rad公司；SDS_PAGE电泳仪系统购自美国Bio-Rad公司。实施例I TRPC5的阻断型本文档来自技高网...
【技术保护点】
阻断型抗体T5E3在逆转肿瘤多药耐药中的应用。
【技术特征摘要】
1.阻断型抗体T5E3在逆转肿瘤多药耐药中的应用。2.根据权利要求I所述阻断型抗体T5E3在逆转肿瘤多药耐药中的应用，其特征在于所述阻断型抗体T5E3的制备方法为用通过人工合成或基因表达方式获得的多肽作为免疫原免疫动物，免疫程序完毕后收集所述动物的血清，并按照常...
【专利技术属性】
技术研发人员：金坚，马鑫，陈蕴，蔡燕飞，何冬旭，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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