基于纤连蛋白III型结构域的多聚体支架制造技术

本发明专利技术提供了特异性结合一个或多个特定靶抗原的基于纤连蛋白III型(Fn3)的多聚体支架。本发明专利技术还提供了同时结合两个或更多个靶抗原的双特异性Fn3-衍生的结合分子、融合物、缀合物以及增强基于Fn3的结合分子的稳定性的方法。此外，本发明专利技术涉及预防剂、治疗剂或诊断剂，所述试剂包含基于Fn3的多聚体支架。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体上涉及抗体模拟物的领域，具体地涉及用于例如产生 具有新型结合特征的产物的基于纤连蛋白III型(Fn3)结构域的多聚体支架。背景能够特异性结合期望的靶表位的生物分子具有作为治疗剂、研究和医学诊断工具的极大重要性。该类分子的公知实例为抗体。可选择特异性结合几乎任何结构表位和具有对于所述表位的亲和カ的抗体。然而，经典抗体是难以在简单真核系统中表达的结构复杂的异源四聚体分子。因此，大多数抗体使用复杂且昂贵的哺乳动物细胞表达系统来产生。具有相对确定的三维结构(通常称为蛋白质支架)的蛋白质可用作用于设计工程产物的试剂。此类支架通常包含一个或多个易于特定或随机序列变异的区域，并且经常进行这样的序列随机化以产生可从其选择期望的产物的蛋白质的文库。其中这类支架是有用的ー个具体领域是抗体模拟物设计的领域。抗体模拟物，即小的非抗体蛋白质治疗剂，利用抗体和抗体片段的有利方面，例如对靶的高亲和カ结合以及低免疫原性和毒性，同时避免ー些缺点，例如抗体片段聚集的倾向以及不如全长IgG稳定。这些缺点可通过使用通过除去抗体天然折叠的部分产生的抗体片段来解決。然而，当通常包埋在疏水环境例如可变结构域与恒定结构域之间的界面中的氨基酸残基变得暴露于溶液时，这通常引起聚集。基干支架的抗体模拟物的ー个实例基于III型(FnIII)的纤连蛋白模块(在门(phyla)间和蛋白质种类间(例如在哺乳动物的血液和结构蛋白质中)被广泛发现的结构域)的结构。FnIII结构域通常存在于多种蛋白质(包括纤连蛋白、生腱蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核生物酶)中(Bork和Doolittle, Proc. Natl.Acad. Sci. USA89:8990-8894，1992 ；Bork 等人，Nature Biotechnol.15:553-557，1997 ；Meinke 等人，J. Bacteriol. 175: 1910-1918，1993 ；ffatanabe 等人，J. Biol.Chem. 265:15659-15665，1990)。第 WO 2009/058379 号 PCT 公布描述了基于 FnIII 结构域(特别地，人生腱蛋白C的第3FnIII结构域)的支架。FnIII结构域包含7个β链(从N端至C端命名为A、B、C、D、E、F和G链)，每ー个链被环区域分隔，其中环区域从N端至C端被命名为AB、BC、⑶、DE、EF和FG环。虽然FnIII结构域不是免疫球蛋白，但人生腱蛋白C结构域的第3FnIII结构域的总体折叠与最小功能性抗体片段(重链的可变区)的折叠密切相关，所述最小功能性抗体片段包含骆驼和美洲驼IgG的完整抗原识别单元。这使得可能在FnIII结构域例如人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的每ー个对侧上以与天然抗体中的CDR的相对定向相似的相对定向展示3个纤连蛋白环。需要开发稳定性增强的人工抗体样分子(其对于多种治疗和诊断应用具有增强的特异性、亲和力、亲合力和稳定性)，以及用于鉴定此类分子的筛选方法。本文中的參考资料的引述或论述不应当被解释为这对于本专利技术是现有技术的承认。 专利技术概述本专利技术提供了重组多聚体支架，其包含衍生自一个或多个目标FnIII结构域(FOI)的两个纤连蛋白III型(FnIII)单体支架，其中(a)每ー个FnIII单体支架包含连接于多个环区域的多个β链，(b) FnI 11単体支架以串联形式连接，其中至少I个单体包含非天然存在的分子内ニ硫键，(c)重组多聚体支架特异性结合至少I个靶，以及(d)对靶的作用与关联FIII単体支架的所述作用相比较得到了增强。本专利技术还提供了重组多聚体支架，其包含衍生自一个或多个目标FnIII结构域(FOI)的3个纤连蛋白III型(FnIII)单体支架，其中(a)每ー个FnIII单体支架包含连接于多个环区域的多个β链，(b)重组多聚体FnIII支架特异性结合至少I个靶，以及(c)对靶的作用与关联FnIII単体支架的所述作用相比较得到了增强。在一些实施方案中，本专利技术的多聚体支架包含3、4、5、6、7或8个FnIII单体支架。在一些实施方案中，多聚体支架的所有FnIII単体支架以串联形式存在。在其它实施方案中，多聚体支架的至少2个FnIII単体支架包含非天然存在的分子内ニ硫键。在ー些其它实施方案中，本专利技术的多聚体支架结合至少2个靶。在一些实施方案中，多聚体支架的至少I个FnIII单体支架通过接头或通过异源部分直接连接于2、3、4、5或6个其它FnIII单体支架。在一些实施方案中，本专利技术的多聚体支架包含7、8、9、10、11或12个FnIII单体支架，其在一些实施方案中可全部以串联形式存在。在一些实施方案中，多聚体支架的至少2个FnIII单体支架通过接头连接。在其它实施方案中，多聚体支架的至少2个FnIII単体支架直接连接而无间插在所述FnIII单体支架之间的接头。在一些实施方案中，多聚体支架的至少I个FnIII単体支架中的多个β链包括命名为A、B、C、D、E、F和G的7个β链。在其它实施方案中，多聚体支架的至少I个FnIII单体支架中的多个环区域包括命名为AB、BC、⑶、DE、EF和FG的6个环区域。在一些实施方案中，对于本专利技术的多聚体支架的至少I个FnIII单体支架，在结合上与关联FnIII単体支架的结合相比较存在增强，其中所述增强在于结合亲和カ和/或结合亲合力的增强。在一些实施方案中，对于靶的结合亲和力和蛋白质稳定性与关联FnIII単体支架的所述结合亲和カ和蛋白质稳定性相比较得到了增强。在其它实施方案中，多聚体支架的对于靶的结合亲合力和蛋白质稳定性与关联FnIII単体支架的所述结合亲合力和蛋白质稳定性相比较得到了增强。在一些实施方案中，本专利技术的多聚体支架的至少I个FnIII单体支架包含至少2个非天然存在的分子内ニ硫键。在一些实施方案中，多聚体支架包括肽接头。肽接头可以为柔性肽接头。在一些实施方案中，接头包含功能性部分，在一些情况下其可以为免疫球蛋白或其片段。在一些实施方案中，将多聚体支架的至少I个FnIII单体支架融合于异源部分例如蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、药物、毒素、细胞毒素剂、成像剂、放射性核素、放射性化合物、有机聚合物、无机聚合物、聚こニ醇(PEG)、生物素、人血清白蛋白(HSA)、HSA FcRn结合部分、抗体、抗体的结构域、抗体片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非-FnIII支架、附加表位、重组多肽聚合物、细胞因子以及两种或更多种所述部分的组合。在一些实施方案中，多聚体支架的超过两个FnIII単体支架通过接头连接，并且至少I个接头在结构上和/或功能上与另外的接头不同。在其它实施方案中，多聚体FnIII支架的FnIII単体支架以分枝形式连接。在其它实施方案中，多聚体支架的ー些FnIII单体支架以线性串联形式进行连接并且ー些FnIII単体支架以分枝形式进行连接。在一些实施方案中，多聚体支架的至少2个FnIII单体支架是相同的，然而在ー些其它实施方案中至少2个FnIII単体支架是不同的。在一些实施方案中，多聚体支架为受 体激动剂。在其它实施方案中，多聚体支架为受体拮抗剂。在一些实施方案中，多聚体支架的至少2个FnII本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.13 US 61/323,7081.一种重组多聚体支架，其包含衍生自一个或多个目标FnIII结构域(FOI)的两个纤连蛋白III型(FnIII)单体支架，其中 (a)每一个FnIII单体支架包含连接于多个环区域的多个0链， (b)所述FnIII单体支架以串联形式连接,其中至少I个所述单体包含非天然存在的分子内二硫键单体支架， (c)所述重组多聚体支架特异性结合至少I个靶，且 (d)对所述靶的作用与关联FnIII单体支架的所述作用相比较得到了增强。2.根据权利要求I所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架包含3、4、5、6、7或8个FnIII单体支架。3.根据权利要求2所述的多聚体支架，其中以线性串联形式连接所有FnIII单体支架。4.根据权利要求I至3中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个FnIII单体支架包含非天然存在的分子内二硫键。5.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架结合至少2个靶。6.根据权利要求2至5中任一项所述的多聚体支架，其中至少I个FnIII单体支架通过接头或通过异源部分直接连接于2、3、4、5或6个其它FnIII单体支架。7.根据权利要求6所述的多聚体支架，其中至少2个FnIII单体支架通过接头连接。8.根据权利要求I至7中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个FnIII单体支架直接连接而无间插在所述FnIII单体支架之间的接头。9.一种重组多聚体支架，其包含衍生自一个或多个目标FnIII结构域(FOI)的3个纤连蛋白III型(FnIII)单体支架，其中 (a)每一个FnIII单体支架包含连接于多个环区域的多个0链， (b)所述重组多聚体FnIII支架特异性结合至少I个靶，且 (c)对所述靶的作用与关联FnIII单体支架的所述作用相比较得到了增强。10.根据权利要求9所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架包含4、5、6、7、8、9、10、11或12个FnIII单体支架。11.根据权利要求10所述的多聚体支架，其中以线性串联形式连接所有FnIII单体支架。12.根据权利要求9至11中任一项所述的多聚体支架，其中至少I个FnIII单体支架包含非天然存在的分子内二硫键。13.根据权利要求9至12中任一项所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架结合至少2个靶。14.根据权利要求9至13中任一项所述的多聚体支架，其中至少I个FnIII单体支架通过接头或通过异源部分直接连接于2、3、4、5或6个其它FnIII单体支架。15.根据权利要求9至14中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个FnIII单体支架通过接头连接。16.根据权利要求9至15中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个FnIII单体支架直接连接而无间插在所述FnIII单体支架之间的接头。17.根据权利要求I至16中任一项所述的多聚体支架，其中至少I个FnIII单体支架中的所述多个P链包括命名为A、B、C、D、E、F和G的7个P链。18.根据权利要求I至16中任一项所述的多聚体支架，其中至少I个FnIII单体支架中的所述多个环区域包括命名为AB、BC、⑶、DE、EF和FG的6个环区域。19.根据权利要求I至18中任一项所述的多聚体支架,其中对于至少I个FnIII单体支架，在结合上与关联FnIII单体支架的所述结合相比较存在增强，其中所述增强在于结合亲和力和/或结合亲合力的增强。20.根据权利要求19所述的多聚体支架，其中对于所述靶的结合亲和力和蛋白质稳定性与关联FnIII单体支架的所述结合亲和力和蛋白质稳定性相比较得到了增强。21.根据权利要求19所述的多聚体支架，其中对于所述靶的所述结合亲合力和蛋白质稳定性与关联FnIII单体支架的所述结合亲合力和蛋白质稳定性相比较得到了增强。22.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少I个FnIII单体支架包含至少2个非天然存在的分子内二硫键。23.根据权利要求6、7、14或15中任一项所述的多聚体支架，其中所述接头包括肽接头。24.根据权利要求23所述的多聚体支架，其中所述肽接头为柔性肽接头。25.根据权利要求6或14中任一项所述的多聚体支架，其中所述接头包含功能性部分。26.根据权利要求25所述的多聚体支架，其中所述功能性部分为免疫球蛋白或其片段。27.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中将至少I个所述FnIII单体支架融合至异源部分。28.根据权利要求6、7、14或15中任一项所述的多聚体支架，其中超过两个所述FnIII单体支架通过接头连接，并且其中至少I个接头在结构上和/或功能上与另外的接头不同。29.根据权利要求2、4-8、10或12-28中任一项所述的多聚体支架，其中以分枝形式连接所述FnIII单体支架。30.根据权利要求2、4-8、10或12-28中任一项所述的多聚体支架，其中一些FnIII单体支架以线性串联形式连接并且一些FnIII单体支架以分枝形式连接。31.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个FnIII单体支架是相同的。32.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个FnIII单体支架是不同的。33.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架为受体激动剂。34.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架为受体拮抗剂。35.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个FnIII单体支架在相同的表位上结合所述相同的靶。36.根据权利要求I至35中任一项所述的多聚体支架，其中至少2个FnIII单体支架在不同的表位上结合所述相同的靶。37.根据权利要求36所述的多聚体支架，其中所述不同表位为非重叠表位。38.根据权利要求36所述的多聚体支架，其中所述不同表位为重叠表位。39.根据前述权利要求中任一项所述的多聚体支架，其中至少I个FOI选自动物FnIII结构域、细菌FnIII结构域、古细菌FnIII结构域和病毒FnIII结构域。40.根据权利要求39所述的多聚体支架，其中至少I个FOI包含选自SEQID NO: 1-34,59,69中的任一个序列和图16中所示的序列的任何序列的序列。41.根据权利要求39所述的多聚体支架，其中至少I个FOI为来自超嗜热古菌的FnIII结构域。42.根据权利要求39所述的多聚体支架，其中所述动物FnIII结构域包含人生腱蛋白C(SEQ ID NO:4)的第三FnIII结构域或其功能性片段。43.根据权利要求39所述的多聚体支架，其中所述动物FnIII结构域包含人纤连蛋白的第HFnIII结构域(SEQ ID NO:69)或其功能性片段。44.根据权利要求39所述的多聚体支架，其中所述动物FnIII结构域包含人纤连蛋白的第IOFnIII结构域(SEQ ID NO:64)或其功能性片段。45.根据权利要求39所述的多聚体支架，其中每一个FnIII单体的FOI包含人生腱蛋白C的第三FnIII结构域(SEQ ID NO:4)或其功能性片段。46.根据权利要求42或45中任一项所述的多聚体支架，其中所述功能性部分为所述人生腱蛋白C的第三FnIII结构域的N末端截断形式(SEQ ID NO: 14)。47.根据权利要求17所述的多聚体支架，其中所述FnIII单体支架中的至少I个的所述@链与SEQ ID NO:4中的所述关联P链具有至少90%的序列同一性。48.根据权利要求17所述的多聚体支架，其中对于至少I个FnIII单体支架，所述A3链结构域包含SEQ ID NO: 41或42，所述链包含SEQ ID NO: 43，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·巴卡，T·迪斯泰德，J·斯维斯，
申请(专利权)人：米迪缪尼有限公司，
类型：
国别省市：