本发明专利技术提供用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原、Nrf1D蛋白抗体及Elisa检测试剂盒，所述免疫原为先合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，以Sulfo‑SMCC为偶联剂，将所述多肽与玥孔戚血蓝蛋白偶联得到；所述抗体以所述免疫原为抗原，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后免疫新西兰白兔，取免疫后的新西兰白兔血进行离心，收集离心后的上清液获得；所述Elisa检测试剂盒组分包括酶标板、包被液、封闭液、酶标二抗、TMB显色液、终止液、检测抗原和所述Nrf1D蛋白抗体，所述检测抗原为合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，以戊二醛为偶联剂，将所述多肽与牛血清白蛋白偶联获得。
【技术实现步骤摘要】
用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原、Nrf1D蛋白抗体及Elisa检测试剂盒
本专利技术属于抗体
，具体涉及用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原、Nrf1D蛋白抗体及Elisa检测试剂盒。
技术介绍
CNC-bZIP是bZIP转录因子的一个亚家族，该亚家族以一个大约40个氨基酸同源域为其特征，该区域与N末端的碱性亮氨酸拉链区域紧邻。从进化角度来看，具有这个同源域的蛋白在秀丽隐杆线虫(Skn1)、黑腹果蝇(cap‘n’collar)、鸡(ECH)[63]、小鼠(Bach)和人的发育过程中，都有广泛的参与。在人体内，目前已知的三个成员(NF-E2、TCF11/LCR-F1/Nrf1和Nrf2)以及它们在鼠科动物体内的同源蛋白都已在证明导致β球蛋白基因位点的谱系特异性表达机制的过程中被分离并鉴定。然而，只有NF-E2才有细胞类型的特异性，Nrf1和Nrf2均没有。相应敲除小鼠的数据和之前的研究(Nrf1结合位点在红色的胆色素原脱氨酶基因、血红素加氧酶1(HO1)基因和NAD(P)H:醌氧化还原酶的表达中起着重要的作用)均表明，这些因子广泛的参与哺乳动物的基因调控。研究发现：启动子元件和转录因子参与小鼠肥大细胞系CPII(用IgE+抗原(Ag)刺激)和小鼠胎儿树突状细胞系DC18(用IgG+Ag刺激)对TNFα的感应。在肥大细胞中，IgE+Ag响应元件被映射到一个与转录因子AP1和NF-ATP1和NF-AT(延伸的κ3/AP1+位点ATGAGCTCATGGGTTTCTCCACCACCAA；黑体部分是AP1和NF-AT位点)相互作用的28bp寡核苷酸上。在小鼠树突状细胞系DC18中，做相应的分析，发现了一个类似的位点(GAGCTCATGGGTTTCTCCACCAA，延伸的κ3/AP1-位点)，这个位点的5′2nt(AT)更短，因此该位点删除了AP1结合位点。在该细胞系中，可以观察到结合这个探针的Nrf1，而在肥大细胞中，使用凝胶转移分析法观察不到任何转录因子与该探针的相互作用。这种差异在功能上受到报告基因载体的5’启动子缺失的支持，该启动子被证明是完整AP1位点的诱导所必需的，但这仅限于肥大细胞而对树突状细胞无效。研究发现，收到IgE+Ag刺激后，在肥大细胞TNFα启动子的AP1复合体中，发现了与几种经典的AP1转录因子(c-jun、junD、fosB和ATF2)结合在一起的Nrf1或与其紧密相关的因子。使用PCR检测/克隆技术，在该细胞系中，已鉴定出Nrf1的六种剪接突变体。其中有几种删除了之前假定的起始和终止密码子；有些剪接突变体，例如Nrf1D，包含一个在bZIP区域发生改变的C末端，这导致了终止子的缺失。这个被改变的亮氨酸拉链区的表达干扰了TNFα对转录过程的诱导作用，这表明，该剪接变体确实能与活化的AP1/NF-AT复合物相互作用。但是目前面临最大的问题是尚未有合适的试剂能检测Nrf1D蛋白的表达情况。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术要解决的技术问题是：针对现有技术中没有能够检测Nrf1D蛋白表达情况的抗体和相关检测试剂盒，而提供用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原、Nrf1D蛋白抗体及Elisa检测试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原，合成氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽，以Sulfo-SMCC为偶联剂，将所述多肽与玥孔戚血蓝蛋白偶联，得到所述用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原。进一步，以所述免疫原为抗原，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后免疫新西兰白兔，取免疫后的新西兰白兔血进行离心，收集离心后的上清液，获得Nrf1D蛋白粗抗体。进一步，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后分别于第1天、第15天、第29天、第43天和第53天免疫新西兰白兔，获得Nrf1D蛋白粗抗体。作为优化，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后颈背部皮下注射免疫新西兰白兔，每只新西兰白兔至少颈背部皮下注射8点进行免疫。作为优化，对所述Nrf1D蛋白粗抗体进行纯化，获得所述Nrf1D蛋白抗体；所述纯化包括如下步骤：将氨基酸序列如SEQIDNO.1的多肽连接到活化的SulfolinkResin上，制备抗原亲和柱，用PBS缓冲液对所述抗原亲和柱进行平衡，将过滤后的Nrf1D蛋白粗抗体过平衡处理后的抗原亲和柱，而后用PBS缓冲液再次进行柱平衡，最后用抗体洗脱液对抗原亲和柱进行洗脱，对洗脱液于280nm处进行吸光度检测，合并收集吸光度大于1.0的洗脱液并以PBS缓冲液为透析液进行透析，获得所述Nrf1D蛋白抗体；其中，所述抗体洗脱液为pH2.7、浓度为0.075g/mL的甘氨酸水溶液。用于检测Nrf1D蛋白的Elisa检测试剂盒，其组分包括酶标板、包被液、封闭液、酶标二抗、TMB显色液和终止液，其组分还包括检测抗原和所述Nrf1D蛋白抗体；其中，所述检测抗原采用如下方法获得：合成氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽，以戊二醛为偶联剂，将所述多肽与牛血清白蛋白偶联，获得所述检测抗原。作为优化，所述包被液为碳酸钠和碳酸氢钠的混合水溶液，所述包被液的pH为9.6。作为优化，所述封闭液由脱脂奶粉溶解于PBS缓冲液中获得。作为优化，所述终止液为2mol/L的硫酸水溶液。作为优化，所述酶标二抗为酶标羊抗兔二抗。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本专利技术选择Nrf1D的C端氨基酸序列合成多肽作为抗原，并以该抗原免疫兔获得本专利技术抗体，本专利技术获得的抗体能够特异性识别Nrf1D蛋白，氨基酸序列经过NCBIblast验证也仅只一致于该蛋白。2、本专利技术还提供了一种用于检测Nrf1D蛋白的Elisa检测试剂盒，该试剂盒对Nrf1D蛋白具有特异性识别能力，能够检测样品中Nrf1D蛋白的表达情况。3、本专利技术还经过蛋白westernblotting实验对抗体进行验证，结果显示本专利技术Nrf1D蛋白抗体的特异性以及灵敏性都极高。4、本专利技术抗体可以用来诊断、预防和/或治疗个体，如：人患者体内一种或多种与Nrf1、Nrf1D相关病症；以及可以用于调节有Nrf1D介导的抗氧化、抗炎症、蛋白酶体功能和调控糖脂代谢平衡反应中的用途。附图说明图1为Nrf1D蛋白抗体的westernblotting试验实验组检测图。图2为Nrf1D蛋白抗体的westernblotting试验对照组检测图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。本实施案例在以本专利技术技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本专利技术具有创造性，但本专利技术的保护范围不限于以下的实施例。一、实验材料1、主要试剂:Sulfo-SMCC、KLH、SulfolinkResin为美国Pierce公司产品，福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂为美国Sigma公司。NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、Tris、Glycine、EDTA、TMB、DMSO、戊二醛等为国产分析纯试剂。2、耗材：透析袋为美国Viskase公司产品，截留分子量14kD。P-10柱为美国BioRad公司产品。3、仪器：磁力搅拌器（上海梅颖浦），旋转混合器（上海强运），紫外/可见光分光光度计（上海奥普勒），高速离心机（日立）4、溶液配置：1、本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原，其特征在于，合成氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽，以Sulfo‑SMCC为偶联剂，将所述多肽与玥孔戚血蓝蛋白偶联，得到所述用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原。
【技术特征摘要】
1.用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原，其特征在于，合成氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的多肽，以Sulfo-SMCC为偶联剂，将所述多肽与玥孔戚血蓝蛋白偶联，得到所述用于获得Nrf1D蛋白抗体的免疫原。2.Nrf1D蛋白抗体，其特征在于，以权利要求1所述免疫原为抗原，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后免疫新西兰白兔，取免疫后的新西兰白兔血进行离心，收集离心后的上清液，获得Nrf1D蛋白粗抗体。3.根据权利要求2所述Nrf1D蛋白抗体，其特征在于，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后分别于第1天、第15天、第29天、第43天和第53天免疫新西兰白兔，获得Nrf1D蛋白粗抗体。4.根据权利要求2所述Nrf1D蛋白抗体，其特征在于，将所述抗原用弗氏完全佐剂乳化后颈背部皮下注射免疫新西兰白兔，每只新西兰白兔至少颈背部皮下注射8点进行免疫。5.根据权利要求2所述Nrf1D蛋白抗体，其特征在于，对所述Nrf1D蛋白粗抗体进行纯化，获得所述Nrf1D蛋白抗体；所述纯化包括如下步骤：将氨基酸序列如SEQIDNO.1的多肽连接到活化的SulfolinkResin上，制备抗原亲和柱，用PBS缓冲液对所述抗原亲和柱进行平衡，将过滤后的Nrf1D蛋白粗抗体过平...
【专利技术属性】
技术研发人员：张义国，汪红霞，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。