hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法及用途技术

本发明专利技术涉及一种hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法及其在膀胱癌治疗药物中的应用。包括以下步骤：a.抗膀胱癌单克隆抗体BDI-1Fab段的制备及纯化；b.用化学连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯制备BDI-1Fab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原；c.抗膀胱癌靶向超抗原的纯化；d.超抗原SEA基因克隆；e.携带超抗原SEA基因的hTERT/ HRE-1双调控增殖型溶瘤腺病毒载体pSG502-SEA的构建、重组和滴度测定。本发明专利技术制备的hTERT/HRE－Ad－SEA复合物对膀胱肿瘤具有生物学干预作用，能够抑制其生殖、分化，诱导其凋亡。

【技术实现步骤摘要】
hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法及用途
本专利技术涉及一种hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法及其在膀胱癌治疗药物中的应用。
技术介绍
肿瘤是危害人类健康的顽症之一，尽管除了手术、放疗和化疗，还有导向治疗、肿瘤疫苗和基因治疗等多种新的疗法，但目前效果仍不尽人意。众所周知，人体的免疫反应具有抗肿瘤作用，它通过细胞免疫机能捕获和消灭机体内新生的肿瘤细胞。而引起肿瘤发生的最终因素都可以归结为机体免疫效应细胞在数量和质量上不足以激发起有效的抗肿瘤免疫应答。因此，从治疗上讲，有效的抗肿瘤策略：(1)增强机体抗肿瘤免疫反应，主要是提高肿瘤局部活化的免疫效应细胞的数量，其中主要组织相容性复合物(MHC)限制性的细胞毒T细胞(CTL/Tc,即杀伤性T细胞)是最重要的免疫监视和效应细胞。(2)采取有效手段直接杀死肿瘤细胞。膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，超过70％的膀胱癌为表浅性膀胱癌，经尿道膀胱肿瘤切除术是表浅性膀胱癌的标准治疗方法，但术后易复发，高达60％～92％。有资料表明膀胱肿瘤局部的淋巴细胞不能被有效活化，进而无法有效地监视肿瘤，造成肿瘤细胞免疫逃逸，是膀胱肿瘤复发的重要原因。因此，如何寻找一种合理有效的生物制剂来达到靶向治疗膀胱癌，以期能够增强膀胱肿瘤局部的免疫功能、杀灭膀胱肿瘤细胞、有效预防膀胱肿瘤复发的效果，是每一个科研工作者及临床医生所面临的以及需要迫切解决的重要问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种对膀胱肿瘤具有生物学干预作用，能够抑制其生殖、分化，诱导其凋亡的hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法及其在膀胱癌治疗药物中的应用。本专利技术的hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法包括以下步骤：a.抗膀胱癌单克隆抗体BDI-1Fab段的制备及纯化：BDI-1加木瓜蛋白酶和β-巯基乙醇，反应得Fab，用磷酸缓冲液(PhosphateBufferedSaline，下称PBS)透析后上蛋白G柱纯化，收集流出峰,超滤离心浓缩,加双蒸水和1MBacine，PH为9.0，得PH8.5含BDI-1Fab的Bacine混合体系备用；b.用化学连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)制备BDI-1Fab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原：将肠毒素A(SEA)和上述步骤a所得Bacine混合液分别以6、10倍过量的摩尔比加入连接剂SPDP，反应得SEA-PDP和Fab-PDP，分别离心取上清，加醋酸钠缓冲液超滤浓缩3次；SEA-PDP中加入1M的二硫代苏糖醇(DTT)反应得SEA-SH，离心，上清加醋酸钠缓冲液，超滤浓缩3次后，加入5倍摩尔过量的Fab-PDP，混合，4℃摇床偶联过夜，得含有BDI-1Fab-SEA的偶联混合物；c.抗膀胱癌靶向超抗原的纯化：BDI-1Fab-SEA的偶联混合物，离心，取上清，过surperdex-200柱，以蛋白质液相层析系统(HighperformanceLiquidChromatography,下称HPLC)纯化并收集产物；d.超抗原SEA基因克隆：以产SEA金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565为模板，根据GenBank已知的SEA基因序列设计1对引物进行PCR扩增后，得到771bpDNA片段；e.携带超抗原SEA基因的hTERT/HRE-1双调控增殖型溶瘤腺病毒载体pSG502-SEA的构建、重组和滴度测定：应用PCR技术将引入SpeI和SalI酶切位点的超抗原SEA基因片段连接到经SpeI和SalI双酶切后的非增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218中，将鉴定正确的非增殖溶瘤腺病毒载体命名为PDC318–SEA；PDC318–SEA经SpeI和SalI双酶切后将超抗原SEA基因片段连接到同样经SpeI和SalI双酶切后的增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒PENTR-12中，将鉴定正确的携带SEA基因增殖溶瘤腺病毒载体命名为PENTR12-SEA；将携带SEA基因的增殖溶瘤腺病毒载体PENTR12-SEA与病毒骨架质粒PPE3重组，得到重组腺病毒-SEA质粒PPE3-SEA；将PPE3-SEA与hTERT/HRE-1双调控增殖腺病毒质粒pSG502共转染至293细胞，共转染后9～14d出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA,应用PCR进行鉴定，经鉴定正确的hTERT/HIF-1双调控溶瘤腺病毒命名为SG502-SEA。本专利技术利用超抗原本身强大的活化T淋巴细胞杀伤膀胱肿瘤细胞作用及病毒载体在肿瘤细胞内扩增带来的溶瘤效应并加以靶向改造使之最大限度地减少毒副作用。将肿瘤特异性启动子-人端粒酶逆转录酶启动子hTERT和缺氧诱导因子HRE-1分别插入腺病毒复制所必需的E1A、E1B基因删除的腺病毒质粒，并插入超抗原SEA基因，成功构建携带超抗原SEA基因的双调控的肿瘤特异性增殖溶瘤腺病毒hTERT/HRE－Ad－SEA复合物，使其能够高效的靶向膀胱肿瘤细胞，既具有在肿瘤细胞内特异性增殖能力又具有强大细胞毒T淋巴细胞刺激能力，进而对膀胱肿瘤细胞产生强大的杀伤作用。通过体外实验证实hTERT/HIF－Ad－SEA复合物具有强大的特异性刺激T细胞增殖和直接溶解肿瘤细胞的双重抗瘤能力；通过建立小鼠膀胱肿瘤模型，通过膀胱灌注的方法证实hTERT/HIF－Ad－SEA复合物直接靶向到达肿瘤局部并限制其仅在瘤区发挥作用，检测膀胱肿瘤组织中E1A、E1B蛋白含量，并观察hTERT/HIF－Ad－SEA复合物对原位膀胱癌小鼠的肿瘤杀伤效应，显示出满意的靶向叠加抑癌效果。通过各项免疫学指标的分析，合理的解释其抗瘤作用的免疫学机制。为尝试解决超抗原临床应用的靶向性和特异性提供实验和理论依据，为靶向基因治疗膀胱癌提供技术平台。具体实施方式本专利技术的实施例的制备和检测步骤如下：步骤1：1.1抗膀胱癌单克隆抗体BDI-1Fab段的制备及纯化：BDI-1加木瓜蛋白酶和β-巯基乙醇，反应得Fab，用磷酸缓冲液(PhosphateBufferedSaline，下称PBS)透析后上蛋白G柱纯化，收集流出峰,超滤离心浓缩,加双蒸水和1MBacine，PH为9.0，得PH8.5含BDI-1Fab的Bacine混合体系备用。1.2用化学连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)制备BDI-1Fab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原：将肠毒素A(SEA)和步骤(1.1)所得Bacine混合液分别以6、10倍过量的摩尔比加入连接剂SPDP，反应得SEA-PDP和Fab-PDP，分别离心取上清，加醋酸钠缓冲液超滤浓缩3次；SEA-PDP中加入1M的二硫代苏糖醇(DTT)反应得SEA-SH，离心，上清加醋酸钠缓冲液，超滤浓缩3次后，加入5倍摩尔过量的Fab-PDP，混合，4℃摇床偶联过夜，得含有BDI-1Fab-SEA的偶联混合物。1.3抗膀胱癌靶向超抗原的纯化：BDI-1Fab-SEA的偶联混合物，离心，取上清，过surperdex-200柱，以蛋白质液相层析系统(HighperformanceLiquidChromatography,下称HPLC)纯化并收集产物。1.4SEA-Fab偶联蛋白抗体活性的鉴定：以BIU-87细胞爬片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法，其特征是：包括以下步骤：a.抗膀胱癌单克隆抗体BDI‑1Fab段的制备及纯化；b.用化学连接剂3‑(2‑吡啶二巯基)丙酸N‑羟基琥珀酰亚胺酯制备BDI‑1Fab‑SEA抗膀胱癌靶向超抗原；c.抗膀胱癌靶向超抗原的纯化；d.超抗原SEA基因克隆；e.携带超抗原SEA基因的hTERT/HRE‑1双调控增殖型溶瘤腺病毒载体pSG502‑SEA的构建、重组和滴度测定：应用PCR技术将引入SpeI和SalI酶切位点的超抗原SEA基因片段连接到经SpeI和SalI双酶切后的非增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218中，将鉴定正确的非增殖溶瘤腺病毒载体命名为PDC318–SEA；PDC318–SEA经SpeI和SalI双酶切后将超抗原SEA基因片段连接到同样经SpeI和SalI双酶切后的增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒PENTR‑12中，将鉴定正确的携带SEA基因增殖溶瘤腺病毒载体命名为PENTR12‑SEA；将携带SEA基因的增殖溶瘤腺病毒载体PENTR12‑SEA与病毒骨架质粒PPE3重组，得到重组腺病毒‑SEA质粒PPE3‑SEA；将PPE3‑SEA与hTERT/HRE‑1双调控增殖腺病毒质粒pSG502共转染至293细胞，共转染后9～14d出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA,应用PCR进行鉴定，经鉴定正确的hTERT/HIF‑1双调控溶瘤腺病毒命名为SG502‑SEA。...

【技术特征摘要】
1.一种hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法，其特征是：包括以下步骤：a.抗膀胱癌单克隆抗体BDI-1Fab段的制备及纯化；b.用化学连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯制备BDI-1Fab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原；c.抗膀胱癌靶向超抗原的纯化；d.超抗原SEA基因克隆；e.携带超抗原SEA基因的hTERT/HRE-1双调控增殖型溶瘤腺病毒载体pSG502-SEA的构建、重组和滴度测定：应用PCR技术将引入SpeI和SalI酶切位点的超抗原SEA基因片段连接到经SpeI和SalI双酶切后的非增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218中，将鉴定正确的非增殖溶瘤腺病毒载体命名为PDC318–SEA；PDC318–SEA经SpeI和SalI双酶切后将超抗原SEA基因片段连接到同样经SpeI和SalI双酶切后的增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒PENTR-12中，将鉴定正确的携带SEA基因增殖溶瘤腺病毒载体命名为PENTR12-SEA；将携带SEA基因的增殖溶瘤腺病毒载体PENTR12-SEA与病毒骨架质粒PPE3重组，得到重组腺病毒-SEA质粒PPE3-SEA；将PPE3-SEA与hTERT/HRE-1双调控增殖腺病毒质粒pSG502共转染至293细胞，共转染后9～14d出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA,应用PCR进行鉴定，经鉴定正确的hTERT/HIF-1双调控溶瘤腺病毒命名为SG502-SEA。2.根据权利要求1所述的hTERT/HRE－Ad－...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔飞伦，
申请(专利权)人：崔飞伦，
类型：发明
国别省市：江苏,32