一种抗BEX2单克隆抗体的制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及医学生物工程技术领域，具体是一种抗BEX2单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC No：C201709的杂交瘤细胞株分泌产生。本发明专利技术还提供分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在检测BEX2中的应用。本发明专利技术的抗BEX2单克隆抗体是一种免疫球蛋白，能够特异性识别BEX2蛋白，对于肿瘤的诊断和治疗具有十分重大的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种抗BEX2单克隆抗体的制备和应用
本专利技术涉及生物工程
，具体地说，是一种抗BEX2单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体在用于检测BEX2中的应用。
技术介绍
越来越多的研究表明，肿瘤细胞与早期胚胎细胞、多能干细胞具有相似性，多种在胚胎期高表达的信号分子、转录因子在肿瘤细胞中的表达也异常增加。其中，一些与胚胎发育和肿瘤相关的癌胚分子已经被广泛地应用于肿瘤的早期诊断和预后分析。例如，癌胚抗原(CarcinoembryonicAntigen，CEA)是胃癌早期诊断的重要标志分子，甲胎蛋白(AlphaFetoprotein，AFP)被用于肝癌的诊断和术后复发的评估。此外，以SALL4等癌胚基因为治疗靶点的抗肿瘤药物也在研发中。因此，癌胚基因对肿瘤的研究、诊断和治疗具有重要意义。BEX2(Brain-expressedX-linked2，BEX2)是定位于X染色体、在脑中高表达，并与胚胎发育相关的基因。通过对人成肝和胎肝的表达谱芯片分析，研究人员发现，BEX2分子在肝脏胚胎期表达显著高于成年期。同时，实时定量PCR检测结果显示BEX2在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织。有报道称，BEX2是重要的雷帕霉素靶蛋白(TargetofRapamycin，mTOP)通路的下游效应因子，参与乳腺癌细胞、神经胶质瘤细胞的增殖和转移。上述研究表明，BEX2是一个癌胚分子，与肿瘤的发生发展密切相关。因此，BEX2是一个很有前景的肿瘤诊断和治疗的靶分子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗BEX2单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的蛋白、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体的应用。本专利技术单克隆抗体的获得可采用本
常规的方法，即通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞并产生腹水抗体，取出腹水经纯化得到。本专利技术的第一方面，提供一种抗BEX2单克隆抗体，是由保藏编号为CCTCCNo：C201709的杂交瘤细胞株分泌产生。所述的抗BEX2单克隆抗体是一种免疫球蛋白，可特异性识别BEX2蛋白。本专利技术的第二方面，提供一种杂交瘤细胞株，命名为mBEX，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期2017年1月6日，保藏编号CCTCCNo：C201709。本专利技术的第三方面，提供一种上述抗BEX2单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：a)针对BEX2的编码框氨基酸全序列(GENEBANKID：568815575)，序列如SEQIDNO：1所示，进行全基因合成，并将序列连接到表达载体中；鉴定阳性克隆，提取及表达菌转化；大量诱导表达生产；Ni磁珠亲和纯化，经纯化，得到蛋白抗原用于免疫；b)将上述蛋白抗原作为免疫原免疫小鼠；c)获取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；d)经多轮筛选出反应阳性的细胞克隆，作为生产抗BEX2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；e)在免疫小鼠体内接种杂交瘤细胞获得腹水抗体，将腹水进行纯化，得到鼠来源的抗BEX2的单克隆抗体。较优的，所述的步骤a中的表达载体为PET28a。较优的，所述的步骤a中的表达菌为大肠杆菌。较优的，所述的步骤a中通过添加终浓度为0.1-1mmol/L的IPTG诱导工程菌产生BEX2蛋白。较优的，所述的步骤b中将蛋白抗原同免疫佐剂混合。其中，取25ul的BEX2蛋白溶液，加入25ul的生理盐水，成为50ul的抗原稀释液，与50ul的免疫佐剂迅速混合，免疫佐剂为KX0210041，即100ul的抗原混合液(此为每只BABL/C小鼠的免疫用量)。较优的，所述的步骤c中免疫小鼠为鼠龄8～12周的雌性BALB/c健康小鼠；取免疫小鼠的脾脏细胞同小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)细胞进行融合。较优的，所述的步骤d中采用倍比稀释技术制备单克隆抗体细胞株，筛选出高特异性、高亲和力的单克隆抗体细胞株，作为抗BEX2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。较优的，所述的步骤e中扩大培养杂交瘤细胞至106个，接种免疫小鼠腹腔，生产腹水抗体，将腹水纯化获得抗BEX2的单克隆抗体。本专利技术的第四方面，提供上述抗BEX2单克隆抗体在制备用于检测BEX2的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。本专利技术的第五方面，提供上述杂交瘤细胞株在在制备用于检测BEX2的免疫检测试剂或试剂盒中的应用。较优的，上述的免疫检测试剂或试剂盒为WesternBlot或免疫组化检测试剂或试剂盒。较优的，上述的免疫检测试剂或试剂盒是检测不同器官组织、不同发育阶段器官组织及肿瘤组织中BEX2的试剂或试剂盒。本专利技术优点在于：本专利技术提供一种抗BEX2单克隆抗体，该单克隆抗体是一种免疫球蛋白，能够特异性识别BEX2蛋白，可以用于制备免疫检测试剂盒或试剂盒为WesternBlot或免疫组化检测试剂或试剂盒，并应用于检测不同器官组织、不同发育阶段器官组织及肿瘤组织中BEX2表达的检测，对于肿瘤的早期诊断和治疗具有十分重大的意义。抗体制备过程中需要高纯度、具有空间结构的抗原以免疫小鼠，而高纯度的BEX2蛋白购买较为困难，本专利技术通过构建工程菌、诱导表达、磁珠纯化的方法获得了纯度较高的BEX2蛋白，为制备高选择性和亲和力的BEX2抗体奠定了基础。生物材料样品的保藏信息：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)地址：中国湖北省武汉市武汉大学保藏日期：2017年1月6日保藏编号：CCTCCNo：C201709分类命名：杂交瘤细胞株mBEX附图说明图1是抗体效价测定结果图，其中1K、3K、9K、27K、81K和162K分别为抗体的稀释倍数。图2是WesternBlot结果图，其中左边的条带为Marker，对应的分子量已经标出，右边的条带为BEX2抗体和蛋白结合条带。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1.抗原蛋白的制备BEX2蛋白氨基酸(GENEBANKID：568815575)，根据其氨基酸序列信息委托苏州省心生物技术有限公司设计并合成了如SEQIDNO:1所述蛋白的基因。构建表达载体；诱导表达；Ni磁珠亲和纯化；获得蛋白抗原。具体方法如下：1)合成BEX2的mRNA序列，并克隆入PET28a载体中。将载体转化入Bl21表达菌中。2)将表达菌添加到LB培养基中，并在37度下扩增，然后加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导表达。3)通过离心，收集细菌沉淀，用5mm变幅杆，35％功率，3.5s工作，7s休息，循环50min，超声破菌。4)Ni磁珠纯化，将磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取5mL磁珠悬液于15mL离心管中，进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下离心管，将表达菌裂解液加入到装有预处理磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡混匀器振荡15s。将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合20～30min。将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，加入10mLWashingBuffer到装有磁珠的离心管中，轻轻翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，弃去上清。重复该操作2-3次，加入2～10mLElutionBuffer，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品。实施例2.抗BEX2的单克隆抗体的制备和纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗BEX2单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC No：C201709的杂交瘤细胞株分泌产生。

【技术特征摘要】
1.一种抗BEX2单克隆抗体，由保藏编号为CCTCCNo：C201709的杂交瘤细胞株分泌产生。2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号CCTCCNo：C201709。3.一种如权利要求1所述的抗BEX2单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)针对BEX2的编码框氨基酸全序列，序列如SEQIDNO：1所示，进行全基因合成，并将序列连接到表达载体中；鉴定阳性克隆，提取及表达菌转化；大量诱导表达生产；Ni磁珠亲和纯化，经纯化，得到蛋白抗原用于免疫；b)将上述蛋白抗原作为免疫原免疫小鼠；c)获取免疫小鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；d)经多轮筛选出反应阳性的细胞克隆，作为生产抗BEX2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；e)在免疫小鼠体内接种杂交瘤细胞获得腹...

【专利技术属性】
技术研发人员：王芳，孙树汉，朱怡卿，刘岩，马金召，黄金凤，袁继行，杨富，薛赓，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海,31