黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法及应用，黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体由名称为：杂交瘤细胞F6-F2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C2015152，保藏日期为：2015年9月13日的杂交瘤细胞株产生；用于对黄颡鱼疫苗免疫效果进行检测评价。本发明专利技术建立了三抗体夹心酶联免疫吸附法，能够对多种疫苗免疫效果进行评价，为疫苗的开发应用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于鱼类免疫学
，具体涉及黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法及应用。
技术介绍
黄颡鱼（Pelteobagrusfulvidraco）是我国常见的一种重要的小型经济鱼类，因其肉质鲜嫩、少细刺，深受消费者喜爱。我国黄颡鱼大规模养殖已有10余年历史，主要集中在两湖及长三角地区。随着其养殖规模的迅速扩大，养殖密度的不断提高，疾病问题日益凸显，其中以细菌性疾病为主。在保护水环境和食品安全的高要求之下，免疫预防成为疾病防治的最佳手段，疫苗是其典型代表。现阶段缺乏有效的黄颡鱼免疫效果评价体系，而利用黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体对免疫后抗体水平变化规律进行分析，可以准确的评价疫苗效果，因此，对黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的研究在疫苗的开发应用中具有重要意义。目前未见关于黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种杂交瘤细胞株，并由该杂交瘤细胞株所产生的黄颡鱼免疫球蛋白的单克隆抗体。本专利技术的另一个目的是提供一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法。本专利技术的再一目的提供一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的用途及其用法。为实现目的之一，本专利技术采用的技术方案是：一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体，所述的单克隆抗体是由名称为：杂交瘤细胞株F6-F2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为：中国武汉省武汉大学；保藏号为：CCTCCNO：C2015152，保藏日期为：2015年9月13日的杂交瘤细胞株产生。为实现目的之二，本专利技术采用的技术方案是：一种所述的黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：将黄颡鱼血清经盐析法和亲和柱层析法纯化得到黄颡鱼免疫球蛋白；以纯化的黄颡鱼免疫球蛋白免疫BALB/c小鼠；融合免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞；经免疫学方法检测，筛选出分泌黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞F6-F2；其所分泌的抗体即为黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体。所述的盐析法和亲和柱层析法是将黄颡鱼血清经饱和硫酸铵(SAS)分级盐析沉淀后获得粗提液，再将粗提液透析后过ProteinA亲和层析柱进行纯化。所述的免疫学方法是间接酶联免疫吸附法。为实现目的之三，本专利技术采用的技术方案是：一种所述的黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体用于对黄颡鱼疫苗免疫效果进行检测评价，所采用的方法是：利用所述黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体建立三抗体夹心酶联免疫吸附法(TAS-ELISA)。本专利技术优点在于：制备了黄颡鱼免疫球蛋白的单克隆抗体及分泌该抗体的杂交瘤细胞株，建立了三抗体夹心酶联免疫吸附法，能够对多种疫苗免疫效果进行评价，为疫苗的开发应用奠定基础。附图说明图1为实施例1所提供的黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的检测黄颡鱼鲇鱼爱德华氏菌强毒株灭活疫苗和弱毒株活疫苗不同方式免疫的血清特异性抗体水平的结果。具体实施方式实施例1：一、黄颡鱼免疫球蛋白的提取黄颡鱼血清的采集：健康黄颡鱼尾静脉采血，室温静置1h，4℃过夜，次日4000r/min离心15min，取上清液，-80℃保存备用。黄颡鱼免疫球蛋白的分离、纯化：饱和硫酸铵(SAS)盐析法：黄颡鱼血清加等体积生理盐水稀释后，缓慢加入pH7.0的饱和硫酸铵至30%饱和度，4℃静置过夜，10000r/min离心30min，取上清继续加入饱和硫酸铵至最终饱和度为50%，同上处理，收集沉淀，沉淀溶解于0.02mol/LPBS（PH7.4），再经PBS4℃透析脱盐，获得黄颡鱼免疫球蛋白粗提液，-80℃保存备用。③ProteinA亲和层析柱纯化：取黄颡鱼免疫球蛋白粗提液1.0mL，与HiTrapProteinAHP柱4℃结合3-4h；用0.02mol/LpH7.4PBS以1.0-1.5mL/min流速洗脱未结合蛋白至OD280<0.01；用0.1mol/LpH3.0柠檬酸以1.0-1.5mL/min流速洗脱洗脱结合蛋白，以200μL/管收集洗脱峰，合并洗脱峰，用0.02mol/LpH7.4PBS4℃透析过夜，-20℃保存备用；该纯化蛋白的重链分子量为73KD，轻链分子量为30KD。二、黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备（1）BALB/c鼠的免疫基础免疫：取纯化的黄颡鱼血清免疫球蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分乳化作为抗原，免疫剂量为0.2ml/尾，背部皮下多点及腹腔注射6周龄BALB/c小鼠。加强免疫：基础免疫2周后，取纯化的黄颡鱼血清免疫球蛋白与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化作为抗原，加强免疫小鼠，免疫剂量与方法同上。二次加强免疫：加强免疫间隔2周后再次加强免疫，免疫剂量与方法同上。融合前三天加强免疫：融合前3d，取纯化的黄颡鱼免疫球蛋白作为抗原，背部皮下多点及腹腔注射小鼠，免疫剂量为0.1ml/尾。（2）细胞融合饲养细胞的制备：脱颈处死正常BALB/c小鼠，无菌条件下打开腹部皮肤，用无菌注射器取PRMI-1640培养基注射到小鼠腹部内，反复抽吸后，将液体全部吸出，移入96孔细胞培养板内，置于37℃、5%CO2培养箱中培养待用。脱颈处死免疫小鼠，无菌条件下取免疫小鼠的脾细胞过100目筛网，与SP2/0骨髓瘤细胞混合于融合管内，1000rpm离心10min，弃去上清；轻弹融合管底，融合管放入37℃水浴中，吸取1mL预热至37℃的PEG4000于1min中内加完，静置90s；继续缓慢加入15mL预热至37℃的PRMI-1640培养基，使PEG失效，再补加25mL的PRMI-1640培养基，1000rpm离心10min，弃去上清；沉淀细胞用预热的含1%HAT的PRMI-1640培养基重悬，加入装有饲养细胞的96孔板，置37℃、5%CO2培养箱培养。培养5-7天后进行换液处理，吸出100μL/孔培养液，加入等量含HAT的培养基。（3）阳性杂交瘤的筛选和克隆筛选：待融合细胞生长到培养孔面积的1/10时，取培养上清用间接ELISA法进行筛选，用纯化的黄颡鱼血清免疫球蛋白作为包被抗原，2μg/mL，100μL/孔，4℃过夜包被；10%小牛血清于37℃封闭3h，用PBST洗涤3次，5min/次；加入杂交瘤上清37℃孵育1h，以SP2/0上清作为阴性对照，阳性对照为免疫血清；同上洗涤3次，加入1:1000辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG37℃孵育1h，100μL/孔；同上洗涤3次孔加入TMB显色液，100μL/孔，于暗处反应30min，加入2mol/L硫酸溶液终止反应，50μL/孔，450nm下读取OD值（P/N≥2.1时本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的单克隆抗体是由名称为：该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞F6‑F2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C2015152，保藏日期为：2015年9月13日。

【技术特征摘要】
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的单克隆抗体是由名称为：该杂交瘤细胞株命
名为杂交瘤细胞F6-F2，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO：
C2015152，保藏日期为：2015年9月13日。
2.一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体，其特征在于，由名称为：杂交瘤细胞F6-F2，保藏
单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO：C2015152，保藏日期为：2015年9月
13日的杂交瘤细胞株产生。
3.如权利要求2所述一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括
如下步骤：（1）将黄颡鱼血清经盐析法和亲和柱层析法纯化得到黄颡鱼免疫球蛋白；（2）以
纯化的黄颡鱼免疫球蛋白免疫BALB/c小鼠；（3）融合免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞；经免疫
学方法检测，筛选出分泌黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞F6-F2，其所分泌的抗
体即为黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体。
4.如权利要求2所述一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的应用，其特征在于，用于对黄
颡鱼疫苗的免疫效果进行检测。
5.根据权利要求3所述一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所
述免疫学方法是间接酶联免疫吸附法。
6.如权利要求3所述一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的应用方法，其特征在于，采用
所述黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体建立三抗体夹心酶联免疫吸附法进行检测。
7.根据权利要求6所述一种黄颡鱼免疫球蛋白单克隆抗体的应用方法，其特征在于，所
述三抗体夹心酶联免疫吸附法的建立的具体操作步骤如下：
ⅰ.取目标菌的强毒株和天然弱毒株培养24-48h，加入甲醛30-40℃灭活24-48h，离心，
弃上清，PBS缓冲液洗涤3-5次，测菌浓度后，加入0.5-2?的硫柳汞，得到包被抗原，2-10℃
保存备用；
ⅱ.取包被抗原分100-150μL/孔，1-5℃过夜；PBST洗涤3-5次，加入封闭液，分200-250
μL/孔，25-37℃孵育3-5h；PBST缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐洋，沈锦玉，姚嘉赟，尹文林，蔺凌云，袁雪梅，潘晓艺，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33