【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于精子体外培养领域，具体涉及一种罗氏沼虾精子体外培养保存方法。
技术介绍
1、现有的罗氏沼虾精子保存技术为冷冻保存。一般采用电击法采集罗氏沼虾精荚，然后破碎精荚，将精子从精荚中释放出来。然后采用低温或超低温冷冻保存罗氏沼虾精子。而电击法取的的精子的成熟度无法保证。一般需人工授精法才确定人工采集保存的精子的活性。目前的技术受限于保存时其精子的生命状态。冷冻保存的精子在保存期间时的生命活动是停滞的，不能在保存期间继续发育。而且冷冻保存技术繁琐，需要专用的设备和药品。冷冻中会对精子有损伤，使大量精子失去活性与受精能力。造成该问题的关键原因可能是研究中没有研究清楚罗氏沼虾精子发育的特点，误认为罗氏沼虾在排出精荚时其精子已经发育成熟。而本专利技术人的研究证实，罗氏沼虾排出精荚后其精子需要在体外继续发育一段时间才能达到完全成熟状态。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种可用于体外培养、细胞毒性小以及精子细胞存活率高的罗氏沼虾精子体外培养保存方法。
2、本专利技术体外培养保存罗氏沼虾精子的方法具有操作简单，成本低的优势。关键是可以让罗氏沼虾精子在保存中继续发育，可以将采集到的未成熟的精子在保存过程中将其培育到完全成熟，大大提高罗氏沼虾精子保存的效率。
3、本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：
4、一种罗氏沼虾精子培养保存液，包括：
5、功能剂，功能剂中至少含有抗生素；
6、罗氏沼虾体液提取物，罗氏沼虾体液提
7、以及无机盐、缓冲试剂和无菌水。
8、优选地，功能剂中还含有3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖，3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖中具有3-甲氧基丙酸基团；或，功能剂中还含有肉桂酰氨基葡萄糖，肉桂酰氨基葡萄糖中具有肉桂酸基团。本专利技术通过在氨基葡萄糖上引入3-甲氧基丙酸基团或肉桂酸基团得到氨基葡萄糖衍生物，然后将其作为功能剂应用于罗氏沼虾精子培养保存液中，进而用于罗氏沼虾精子的体外培养，发现该氨基葡萄糖衍生物与功能剂中的抗生素共同使用时，可以提高罗氏沼虾精子的细胞存活率。
9、更优选地，罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.01-0.05wt%的3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖；或，罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.01-0.05wt%的肉桂酰氨基葡萄糖。
10、优选地，无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和硫酸钠；或，罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.1-5wt%的无机盐；或，罗氏沼虾精子培养保存液中含有8×105-106u/l的抗生素；或，罗氏沼虾精子培养保存液中罗氏沼虾体液提取物的含量为30-60wt%；或，缓冲试剂为hepes。
11、优选地，功能剂中还含有糖分，糖分为葡萄糖。
12、优选地，罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.2-0.5wt%的葡萄糖。
13、优选地，3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖的制备中，包括3-甲氧基丙酰氯的制备和3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖的制备。
14、更优选地，3-甲氧基丙酰氯的制备中，将3-甲氧基丙酸和亚硫酰氯混合，在60-80℃的温度下搅拌处理5-30min，然后在80-100℃下反应0.5-3h，反应完成后，减压蒸馏除去亚硫酰氯，得到3-甲氧基丙酰氯。
15、更优选地，3-甲氧基丙酰氯的制备中，3-甲氧基丙酸的使用量为亚硫酰氯的20-40wt%。
16、更优选地，3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖的制备中，将氨基葡萄糖加入蒸馏水中搅拌混合，然后加入碱性试剂，在20-40℃的温度下反应20-60min，然后加入3-甲氧基丙酰氯溶液进行反应0.5-3h，反应过程中控制ph值稳定，反应完成后，抽滤，滤饼经石油醚洗涤，干燥，得到3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖。
17、更优选地，3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖的制备中，氨基葡萄糖的使用量为蒸馏水的10-30wt%。
18、更优选地，3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖的制备中，碱性试剂为氢氧化钠，碱性试剂的使用量为氨基葡萄糖的3-10wt%。
19、更优选地，3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖的制备中，3-甲氧基丙酰氯溶液由3-甲氧基丙酰氯与丙酮混合而成，3-甲氧基丙酰氯溶液中含有20-60wt%的3-甲氧基丙酰氯，3-甲氧基丙酰氯溶液的使用量以其中3-甲氧基丙酰氯的量为计量基准，3-甲氧基丙酰氯的使用量为氨基葡萄糖的50-100wt%。
20、优选地，肉桂酰氨基葡萄糖的制备中，包括肉桂酰氯的制备和肉桂酰氨基葡萄糖的制备。
21、更优选地，肉桂酰氯的制备中，将肉桂酸和亚硫酰氯在60-90℃的温度下混合，搅拌处理0.5-3h，然后在90-120℃的温度下反应1-4h，反应完成后，减压蒸馏除去亚硫酰氯，得到肉桂酰氯。
22、更优选地，肉桂酰氯的制备中，肉桂酸的使用量为亚硫酰氯的20-40wt%。
23、更优选地，肉桂酰氨基葡萄糖的制备中，将氨基葡萄糖加入蒸馏水中搅拌混合，然后加入碱性试剂，在20-40℃的温度下反应20-60min，然后加入肉桂酰氯溶液进行反应0.5-3h，反应过程中控制ph值稳定，反应完成后，抽滤，滤饼经石油醚洗涤，干燥，得到肉桂酰氨基葡萄糖。
24、更优选地，肉桂酰氨基葡萄糖的制备中，氨基葡萄糖的使用量为蒸馏水的10-30wt%。
25、更优选地，肉桂酰氨基葡萄糖的制备中，碱性试剂为氢氧化钠，碱性试剂的使用量为氨基葡萄糖的3-10wt%。
26、更优选地，肉桂酰氨基葡萄糖的制备中，肉桂酰氯溶液由肉桂酰氯与丙酮混合而成，肉桂酰氯溶液中含有20-60wt%的肉桂酰氯，肉桂酰氯溶液的使用量以其中肉桂酰氯的量为计量基准，肉桂酰氯的使用量为氨基葡萄糖的50-100wt%。
27、优选地，功能剂中还可以加入肉桂酰氨基葡萄糖酯。本专利技术进一步通过在氨基葡萄糖上引入肉桂酸基团和3-甲氧基丙酸基团，肉桂酸与氨基葡萄糖上的氨基键合，3-甲氧基丙酸与氨基葡萄糖上的羟基键合，在肉桂酸基团和3-甲氧基丙酸基团的共同作用下，得到的肉桂酰氨基葡萄糖酯与抗生素共同使用时，具有更优的性能，提高罗氏沼虾精子的细胞存活率。
28、更优选地，肉桂酰氨基葡萄糖酯的制备中，将肉桂酰氨基葡萄糖加入二氯甲烷中，在30-50℃下搅拌处理10-30min，然后加入3-甲氧基丙酰氯酯化溶液，在50-100℃的温度下反应0.5-3h，反应完成后，蒸馏除去二氯甲烷，得到肉桂酰氨基葡萄糖酯。
29、更优选地，肉桂酰氨基葡萄糖酯的制备中，肉桂酰氨基葡萄糖的使用量为二氯甲烷的20-40wt%。
30、更优选地，肉桂酰氨基葡萄糖酯的制备中，3-甲氧基丙酰氯酯化溶液由3-甲氧基丙酰氯与二氯甲烷混合而成，3-甲氧基丙酰氯酯化溶液中含有20-50wt%的3-甲氧基丙酰氯，3-甲氧基丙酰氯酯化溶液的使用量以其中3-甲氧基丙酰氯为计量基准，3-甲氧基丙酰氯的使用量为肉桂酰氨基葡萄糖的40-80wt%。
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【技术保护点】
1.一种罗氏沼虾精子培养保存液，包括：
2.根据权利要求1所述的一种罗氏沼虾精子培养保存液，其特征是：所述功能剂中还含有3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖，3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖中具有3-甲氧基丙酸基团；或，所述功能剂中还含有肉桂酰氨基葡萄糖，所述肉桂酰氨基葡萄糖中具有肉桂酸基团。
3.根据权利要求2所述的一种罗氏沼虾精子培养保存液，其特征是：所述罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.01-0.05wt%的3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖；或，所述罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.01-0.05wt%的肉桂酰氨基葡萄糖。
4.根据权利要求1所述的一种罗氏沼虾精子培养保存液，其特征是：所述无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和硫酸钠；或，所述罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.1-5wt%的无机盐；或，所述罗氏沼虾精子培养保存液中含有8×105-106U/L的抗生素；或，所述罗氏沼虾精子培养保存液中罗氏沼虾体液提取物的含量为30-60wt%；或，所述缓冲试剂为HEPES。
5.根据权利要求1所述的一种罗氏沼虾精子培养保存液，其特征是：所述功能剂中还含有糖分，
6.根据权利要求1所述的一种罗氏沼虾精子培养保存液，其特征是：所述罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.2-0.5wt%的葡萄糖。
7.一种罗氏沼虾精子体外培养保存方法，包括：将罗氏沼虾雄虾的精荚取出后，于权利要求1所述的罗氏沼虾精子培养保存液中进行罗氏沼虾精子体外培养。
8.根据权利要求7所述的一种罗氏沼虾精子体外培养保存方法，其特征是：所述方法还包括雄虾预培养，将雄虾于培养池中进行预培养；或，所述罗氏沼虾精子体外培养前还包括雄虾精荚的提取步骤，采用5-17V直流电池电击雄虾生殖孔基部，以取出雄虾精荚。
9.根据权利要求8所述的一种罗氏沼虾精子体外培养保存方法，其特征是：所述雄虾精荚的提取后还有雄虾精荚的破碎步骤，然后再进行罗氏沼虾精子体外培养；所述破碎步骤中将精荚磨碎，使精子从精荚中释放出，同罗氏沼虾精子培养保存液制成精子悬液。
10.根据权利要求7所述的一种罗氏沼虾精子体外培养保存方法，其特征是：所述精荚与罗氏沼虾精子培养保存液的配制关系为0.5-2个/mL。
...【技术特征摘要】
1.一种罗氏沼虾精子培养保存液，包括：
2.根据权利要求1所述的一种罗氏沼虾精子培养保存液，其特征是：所述功能剂中还含有3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖，3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖中具有3-甲氧基丙酸基团；或，所述功能剂中还含有肉桂酰氨基葡萄糖，所述肉桂酰氨基葡萄糖中具有肉桂酸基团。
3.根据权利要求2所述的一种罗氏沼虾精子培养保存液，其特征是：所述罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.01-0.05wt%的3-甲氧基丙酰氨基葡萄糖；或，所述罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.01-0.05wt%的肉桂酰氨基葡萄糖。
4.根据权利要求1所述的一种罗氏沼虾精子培养保存液，其特征是：所述无机盐包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和硫酸钠；或，所述罗氏沼虾精子培养保存液中含有0.1-5wt%的无机盐；或，所述罗氏沼虾精子培养保存液中含有8×105-106u/l的抗生素；或，所述罗氏沼虾精子培养保存液中罗氏沼虾体液提取物的含量为30-60wt%；或，所述缓冲试剂为hepes。
5.根据权利要求1所述的一种罗氏沼虾精子培养保存液，其特征是：所...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄振远，张海琪，慎佩晶，高强，郭建林，原居林，徐洋，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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