一种人可溶性ICOSL ELISA试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种人可溶性ICOSL ELISA试剂盒及其检测方法。具体而言，本发明专利技术的ELISA试剂盒包括一对抗人可溶性ICOSL单克隆抗体2B4和20B10，其分别由杂交瘤细胞株2B4（保藏编号为CGMCC NO:11291）和20B10（保藏编号为CGMCC NO:11187）产生，并分别用作改良双抗体夹心ELISA方法中的检测抗体和包被抗体。本发明专利技术利用该试剂盒成功完成了人可溶性sICOSL的定量检测，不仅具有较高的检测灵敏度，而且具有较好的检测特异性，开发及应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫分析
，涉及一种定量检测人可溶性ICOSL的ELISA试剂盒，利用该试剂盒进行定量检测的方法。
技术介绍
目前已知的许多受体-配体相互作用都参与诱导、建立和调节抗原特异性免疫反应，其中T细胞的活化需要双信号，抗原肽-MHC分子复合物与T细胞受体（TCR）的结合提供了第一信号，而第二信号则来源于抗原呈递细胞（APC）和T细胞表面共刺激分子（costimulatorymolecule）的相互作用，缺乏第二信号将导致T细胞失能或程序性死亡。由此可见，共刺激信号是T细胞克隆扩增、分化和发挥生物效应所必不可少的。近年来，随着分子生物学技术被广泛应用于免疫学研究，共刺激分子被不断发现。这些共刺激分子按其结构的不同可分为两类：一类是肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体（TNF/TNFR）超家族，包括CD40/CD40L、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL、OX40/OX40L、RANK/RANKL和Fas/FasL等；另一类是免疫球蛋白（Ig）超家族，包括CD28/CTLA4-B7、LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、ICOS-ICOSL、CD2-LFA-3等。这些共刺激分子以受体和配体相互作用的方式传导信号。受体和配体一般表达在不同的细胞表面，通常一个为持续性表达，一个是诱导性表达。在免疫应答的不同阶段，这些分子以各自独特而又相关联的方式参与信号传导，共同调控机体的免疫应答。可诱导共刺激分子（induciblecostimulator，ICOS）是1999年由Hutloff等人发现的CD28家族的新成员，ICOS是由两个亚单位构成的同源二聚体I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族。ICOS的胞浆区含有YMFM基序，能与PI3K激酶结合，胞外区含有一个V样Ig功能区，其中的FDPPF基序是与相应配体ICOSL结合的结构，ICOS主要表达于滤泡辅助性T细胞（Tfollicularhelper，Tfh）、活化T细胞和效应/记忆性T细胞上。ICOS的配体ICOSL（又称为hB7RP-1，B7-H2，hLICOS）是由309个氨基酸组成的I型跨膜糖蛋白，约63~72kDa，胞外区包含IgV、IgC区，胞内段则根据不同的生理环境及细胞自身的状态而剪接形成不同的异构体，其中的4个半胱氨酸及IgV区80位的酪氨酸都是保守位点，不仅是B7家族的标志性位点，而且对于免疫球蛋白样结构的形成也十分重要。ICOSL主要表达在B细胞（例如淋巴结的皮质区和淋巴滤泡、脾的边缘带，此外在扁桃体B细胞的表面也有低水平表达）、单核细胞、部分树突状细胞和巨噬细胞上，提示ICOSL在B细胞参与的体液免疫应答中可能发挥着重要作用。除在淋巴组织表达以外，ICOSL在肾、心、膀胱和脑等非淋巴组织也有表达，表明该分子可能具有多方面的功能。多种因素可调控ICOSL的表达，外周血中未经刺激的B细胞、单核细胞表面低水平表达ICOSL，经IFN-γ、TNF-α、LPS刺激后，ICOSL的表达迅速上调。ICOS的生物学功能与经典共刺激分子CD28不尽相同。CD28是诱导初始T细胞增殖活化的关键性分子，而ICOS则是活化后促进T细胞分化并发挥效应的主要共刺激分子。CD28主要参与机体的初次免疫应答，而ICOS主要是在再次免疫应答以及免疫记忆中发挥重要作用，对维持T细胞效应和记忆细胞活化、免疫球蛋白类型转换、调节Th1/Th2细胞极化等有重要作用。另外，ICOS在体内实验中所扮演的重要角色之一就是维持Tfh的产生，因此无论对于人类还是小鼠而言，ICOS缺陷都会导致Tfh生成缺陷，影响生发中心（germinalcenter，GC）反应，并使抗体产生减少。此外，已有研究证明，抗原呈递细胞上的ICOSL对于Tfh细胞分化和维持都有重要作用。清华大学祁海教授新近在Nature等杂志上发表文章指出，ICOS可以在独立于共刺激信号之外，通过促进T细胞的随机运动能力来直接控制T细胞向淋巴器官滤泡区迁移，进而决定T细胞的分化方向，但旁观者B细胞表达ICOSL是其必要条件。当旁观者B细胞无法表达ICOSL时，活化的辅助T细胞无法正常发育为Tfh，也不能引起最佳的GC反应，这说明旁观者B细胞在促进Tfh发育中起着至关重要的作用。ICOS/ICOSL信号通路的异常与多种自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化等）的发病密切相关。类风湿性关节炎是一种由多种因素导致的自身免疫性疾病，在类风湿性关节炎患者及小鼠动物模型中均发现多种免疫学功能的异常，其中最突出的就是产生致病性的自身抗体、T细胞/B细胞免疫功能的缺陷、自身抗体及免疫复合物清除障碍等。类风湿性关节炎患者体内T细胞/B细胞相互作用时通过共刺激分子产生的抗凋亡信号促使自身反应性B细胞大量增殖，并产生高滴度的自身抗体，而这些自身抗体的某些亚型及其免疫复合物介导了疾病的组织损伤。在多个独立实验中，采用抗体阻断ICOS与其配体的相互作用，可以减少促炎症因子的产生及抗体的形成，并且显著减弱关节炎的严重程度，还可以减少CIA模型小鼠的引流淋巴结和脾的滤泡辅助T细胞和生发中心B细胞的数量。由此可见，ICOS途径在类风湿性关节炎的免疫病理过程中发挥复杂而重要的作用。大量研究表明，许多共刺激分子以细胞膜型和可溶性两种形式存在。其中，可溶性分子大多通过膜型分子而形成，但也有某些可溶性分子由专一的缺失跨膜区的基因编码（例如CTLA-4）。机体中可溶性分子和膜表面的分子一样具有相应的生物学功能：一方面，细胞膜上的分子能够通过直接的受体/配体相互作用来介导共刺激信号；另一方面，可溶性蛋白因子能够像细胞因子一样参与血液循环，并且在免疫应答中发挥重要的调节作用，其既能够影响邻近细胞，又能够和远端细胞表面的受体相互结合，从而参与疾病的发生、发展，其发挥作用的广度和深度远远超过细胞膜表面的分子。迄今为止，因缺乏有效的检测方法，国内外尚未有对可溶性ICOSL（sICOSL）的研究报道。
技术实现思路
要解决的技术问题：针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种基于改良双抗体夹心ELISA方法研制的人可溶性ICOSLELISA试剂盒，并利用该试剂盒成功完成了人sICOSL的定量检测。技术方案：一对用于制备抗人可溶性ICOSL单克隆抗体的杂交瘤细胞株：杂交瘤细胞株2B4，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCCNO:11291，保藏日为2015年10月21日，保藏地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一对用于制备抗人可溶性ICOSL单克隆抗体的杂交瘤细胞株：杂交瘤细胞株2B4，保藏编号为CGMCC NO.11291；杂交瘤细胞株20B10，保藏编号为CGMCC NO:11187。

【技术特征摘要】
1.一对用于制备抗人可溶性ICOSL单克隆抗体的杂交瘤细胞株：
杂交瘤细胞株2B4，保藏编号为CGMCCNO.11291；
杂交瘤细胞株20B10，保藏编号为CGMCCNO:11187。
2.根据权利要求1所述的一对杂交瘤细胞株在制备人可溶性ICOSLELISA试剂盒中的
用途，其中：
所述杂交瘤细胞株2B4用于产生检测抗体；
所述杂交瘤细胞株20B10用于产生包被抗体。
3.一对抗人可溶性ICOSL单克隆抗体：
单克隆抗体2B4，其由根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株2B4产生，其包括轻链和重
链，其氨基酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示，其编码基因的核苷酸序列分别
如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；
单克隆抗体20B10，其由根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株20B10产生，其包括轻链和
重链，其氨基酸序列分别如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示，其编码基因的核苷酸序列分
别如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。
4.根据权利要求3所述的一对抗人可溶性ICOSL单克隆抗体在制备人可溶性ICOSL
ELISA试剂盒中的用途，其中：
所述单克隆抗体2B4用作检测抗体；
所述单克隆抗体20B10用作包被抗体。
5.一种人可溶性ICOSLELISA试剂盒，其包括如下组分：
1）固相载体：酶标板，1块；
2）包被抗体：抗人ICOSL单克隆抗体20B10，30μg/管，1管；
3）检测抗体：抗人ICOSL单克隆抗体2B4，10μg/管，1管；
4）抗体稀释液：0.01M碳酸盐缓冲液，pH9.6，50mL/瓶，1瓶；
5）封闭液：牛血清白蛋白溶液，2g/100mL，30mL/瓶，1瓶；
6）样品稀释液：0.01M磷酸盐缓冲液，含有0.5%牛血清白蛋白，250mL/瓶，1瓶；
7）标准品蛋白：ICOSL-Ig融合蛋白，25ng/管，1管；
8）酶标二抗：链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物，10μg/管，1管；
9）底物：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，10mL/管，1管；
10）洗液：0.01M磷酸盐缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学光，刘翠平，胡筱涵，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32