一种利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法，属于酶工程领域。本发明专利技术分别对环糊精葡萄糖基转移酶催化染料木素糖基化反应体系中的糖基供体种类，染料木素溶剂种类，底物浓度及配比，酶的浓度，以及反应温度、pH和时间进行了优化。分别以可溶性淀粉和染料木素作为糖基化供体和受体，以环糊精葡萄糖基转移酶作为催化剂，在最适反应条件下，糖基化染料木素产物的产量达到最大化，特别是对于主产物(Glc)

【技术实现步骤摘要】
一种利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法
本专利技术公开了一种利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法，属于酶工程领域。
技术介绍
染料木素(又名金雀异黄素、染料木黄酮等)被认为是一种重要的大豆异黄酮，主要存在于大豆种子的子叶和胚轴中。染料木素在人体及动物细胞中具有广泛的药理学功效。主要表现为：1)具有化学防癌(乳腺癌和前列腺癌等)作用。染料木素具有类雌性激素及抗激素作用，可以抑制肿瘤细胞合成过程中相关酶的活性，在肿瘤细胞形成过程中抑制肿瘤血管增生，延缓或阻止肿瘤变成癌细胞。2)可以预防心血管疾病。染料木素会激发低密度的脂蛋白受体产生正向调节作用，同时可以促进胆固醇的清除，抑制血小板的凝集，对于动脉粥样硬化等疾病具有预防和治疗作用。3)可以预防绝经后疾病。染料木素是典型的植物雌激素，所具有的雌激素活性能够缓解妇女更年期综合症及预防绝经后疾病。4)抗骨质疏松作用。染料木素的雌激素活性能够激活雌激素受体，提高成骨细胞活性；另外还可以增加骨密度，抑制骨量丢失，对骨质疏松具有较好的改善作用。染料木素易溶于二甲基亚砜和乙醇等有机溶剂，几乎不溶于水。此特性严重限制了其作为食品添加剂和口服药物及静脉注射药剂等在食品和医药行业中的应用。近年来，为了提高染料木素在水溶液中的溶解度，大量染料木素衍生物受到了人们的关注。其中染料木素的糖基化衍生物因其与染料木素具有相似的生理生化功能、安全性较高、具有较高的水溶性等优点被认为是最佳的染料木素替代物之一，具有十分重要的应用价值。据报道双葡萄糖基染料木素和三葡萄糖基染料木素在水中的溶解度分别是染料木素的3700倍和44000倍，且共价连接糖链越长，水溶性越好。但是与染料木素连接的糖链越长，越不稳定，易被水解。我们利用环糊精葡萄糖基转移酶催化染料木素糖基化反应，通过对反应体系及反应条件进行优化，最终获得了提高染料木素糖基化衍生物产量的最佳条件。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供一种利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法。所述的利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法，主要步骤如下：1)将染料木素溶解于二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为5～10g/L的溶液，作为糖基受体；2)将可溶性淀粉溶解于50mM的PBS缓冲液(pH6.0～7.5)中配制成浓度为30～50g/L的溶液，作为糖基供体；3)将环糊精葡萄糖基转移酶溶解于50mM的PBS缓冲液(pH6.0～7.5)中配制成浓度为10～40g/L的溶液。4)1mL反应体系中含有可溶性淀粉溶液，染料木素溶液以及环糊精葡萄糖基转移酶溶液比例为4/4/2～6/2/2)，混合并放置于2mL带盖子的小管内。于30～50℃震荡器中缓慢震荡15～25h左右。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。本专利技术的有益效果：本专利技术通过优化环糊精葡萄糖基转移酶催化染料木素糖基化反应条件，提高了糖基化染料木素产物的产量。特别是对于主产物(Glc)2-genistein，在最适条件下其产量较优化前有大幅度的提高。附图说明图1不同用于溶解染料木素的溶剂对染料木素糖基化衍生物合成的影响。图2不同糖基供体对染料木素糖基化衍生物合成的影响。图3不同可溶性淀粉浓度对染料木素糖基化衍生物合成的影响。图4不同染料木素浓度对染料木素糖基化衍生物合成的影响。图5不同底物配比(可溶性淀粉/染料木素，v/v)对染料木素糖基化衍生物合成的影响。图6不同酶浓度对染料木素糖基化衍生物合成的影响。图7不同反应pH对染料木素糖基化衍生物合成的影响(pH4.5～6.0，醋酸-醋酸钠缓冲液；pH6.0～8.0,PBS缓冲液)。图8不同反应温度对染料木素糖基化衍生物合成的影响。图9不同反应时间对染料木素糖基化衍生物合成的影响。具体实施方式：实施例1：不同溶剂溶解染料木素对糖基化染料木素产物合成的影响。取0.1g染料木素分别溶解于10mL的DMSO，甲醇，乙醇，水，乙酸乙酯等不同溶剂中配制成不同的染料木素溶液。然后取300μL染料木素溶液，500μL浓度为10g/Lα-环糊精溶液(溶剂为pH6.5的50mMPBS缓冲液)，200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH6.5的50mMPBS缓冲液)混合于2mL带盖子的小管内。于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。如图1所示，当用DMSO作为染料木素溶剂时，糖基化染料木素衍生物产量最高。因此选用DMSO作为染料木素溶剂。实施例2：不同糖基供体对糖基化染料木素产物合成的影响。分别选用α-环糊精，β-环糊精，可溶性淀粉，麦芽糊精，麦芽糖，葡萄糖，蔗糖作为糖基供体，溶解于pH6.5的50mMPBS缓冲液中配制成浓度为10g/L的溶液。然后分别取500μL糖基供体与300μL浓度为10g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)以及200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH6.5的50mMPBS缓冲液)混合于2mL带盖子的小管内。于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。如图2所示，当选α-环糊精作为糖基供体时，染料木素糖基化产物产量最高。但因为α-环糊精价格昂贵，增加了成本，因此不是最合适的糖基供体。而可溶性淀粉作为糖基供体时，染料木素糖基化产物产量均高于较其他糖基供体(除α-环糊精外)。因此选用可溶性淀粉作为糖基供体。实施例3：不同可溶性淀粉浓度对糖基化染料木素产物合成的影响将可溶性淀粉溶于pH6.5的50mMPBS缓冲液中分别配制成不同浓度(10，20，30，40，50g/L)，然后分别取500μL不同浓度可溶性淀粉溶液与300μL浓度为10g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)以及200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH6.5的50mMPBS缓冲液)混合于2mL带盖子的小管内。于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。如图3所示，当可溶性淀粉浓度为40g/L时，染料木素糖基化衍生物产量最高。所以选取可溶性淀粉最适浓度为40g/L。实施例4：不同染料木素浓度对糖基化染料木素产物合成的影响将染料木素溶于DMSO中分别配制不同浓度(1，2.5，5，7.5，10g/L)，然后分别取300μL不同浓度的染料木素溶液与500μL浓度为40g/L可溶性淀粉溶液(溶剂为pH6.5的50mMPBS缓冲液)以及200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH6.5的50mMPBS缓冲液)混合于2mL带盖子的小管内。于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。如图4所示，当染料木素浓度为7.5g/L时，染料木素糖基化衍生物产量最高。所以选取染料木素最适浓度为7.5g/L。实施例5：不同底物配比(可溶性淀粉/染料木素，v/v)对糖基化染料木素产物合成的影响分别取不同体积配比的初始浓度为40g/L可溶性淀粉溶液(溶剂为pH6.5的50mMPBS缓冲液)和初始浓度为7.5g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)(如可溶性淀粉体积/染料木素体积分别为200μL/600μL，300μL/500本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法，其特征在于：在环糊精葡萄糖基转移酶转糖基作用下将糖基供体上的糖基转移至染料木素合成糖基化染料木素衍生物。其反应是在最适的染料木素溶剂，糖基供体，底物浓度及配比，酶的浓度，以及反应温度、pH和时间等条件下进行。

【技术特征摘要】
1.一种利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法，其特征在于：在环糊精葡萄糖基转移酶转糖基作用下将糖基供体上的糖基转移至染料木素合成糖基化染料木素衍生物。其反应是在最适的染料木素溶剂，糖基供体，底物浓度及配比，酶的浓度，以及反应温度、pH和时间等条件下进行。2.根据权利要求1所述的最适染料木素溶剂，其特征在于以DMSO作为最适染料木素溶剂。3.根据权利要求1所述的最适糖基供体，其特征在于以可溶性淀粉作为最适糖基供体。4.根据权利要求1所述的最适底物...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩瑞枝，倪晔，姜明杨，葛彬彬，许国超，董晋军，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32