一种生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法及其专用菌株技术

本发明专利技术公开了一种生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法及其专用菌株。本发明专利技术所提供的嗜碱芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＡ－１　　ＣＧＭＣＣ　　№　　１２７８可用于发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶。嗜碱芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＡ－１　　ＣＧＭＣＣ　　№　　１２７８产酶水平高、发酵时间短，且产酶具有传代稳定性，１０Ｌ发酵罐中发酵２４ｈ产酶活力（酶产量）可达到６１００Ｕ／ｍｌ；５０００Ｌ发酵罐中发酵２０．５ｈ产酶活力就可达到６８７５Ｕ／ｍｌ。本发明专利技术的方法及其专用菌株将在环糊精葡萄糖基转移酶的生产中发挥重要作用，具有广阔的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中一种生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法及其专用菌株。
技术介绍
利用环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase，CGTase)可将来源丰富、价格低廉的淀粉类物质转化成β-环糊精(β-CD)。β-CD及其衍生物做为添加剂或包埋材料在食品、医药、农药及环保领域用途广泛且具有无毒副作用、包埋用量大的特点。我国β-CD的生产虽有20多年的历史，但由于生产菌种酶产量不高及β-CD生产成本过高而导致其应用受到限制，因此，选育CGTase高产菌是我国酶制剂研究的一项重要任务。优良的菌种是提高CGTase活力的关键，而适宜的生产方法和培养条件是发挥优良菌种性能、获得高产酶量的保证。环糊精葡萄糖基转移酶可由嗜碱芽孢杆菌发酵生产，但目前微生物发酵生产环糊精葡萄糖基转移酶的产量不高，且发酵时间较长。离子注入诱变育种是近年来兴起的一种新型诱变育种方法，已在农作物及工业微生物菌种的诱变育种领域取得丰硕成果(汪秀峰，吴敬德。离子注入改良水稻广亲和系02428。安徽农业大学学报，1999，26(4)423-426；桑金隆，竺莉红，李孝辉。离子注入诱变选育之江菌素产生菌。科技通报，2002，18(1)63-66)。注入离子对生物体的作用是集能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷的中和与交换于一体的联合作用(余增亮，霍裕平。离子注入生物学研究述评。安徽农业大学学报，1994，21(3)221-225)。离子注入对生物细胞既存在着直接作用又存在着间接作用，注入离子的动量传递产生了对细胞的直接作用，其能量沉积显示着对细胞的间接作用。已有研究表明质量沉积作用能诱导注入的生物分子或细胞内生成新产物(邵春林，余增亮。低能离子辐照的刺激效应模型。核技术，1996，19(6)321-325)。生物大分子中不乏氮元素，因此氮离子注入对生物体的诱变作用是多重性的，它与γ-射线或紫外线诱变有所不同，是损伤及修复同时进行的一种复合诱变。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法及其专用菌株。本专利技术所提供的生产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)HA-1，已于2004年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 1278。该菌株的细胞呈杆状，直径小于1μM，孢囊膨大，中生或次端生芽孢，革兰氏染色阳性，菌落圆滑呈黄橙色，好氧，在pH值8.5-9.5条件下生长良好。本专利技术所提供的生产环糊精葡萄糖基转移酶的方法，是由嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278发酵得到的。其中，所述嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的发酵培养基包括玉米粉或玉米淀粉1.5％-2.5％，蛋白质含量≥40％的玉米浆5.0％-6.5％；所述百分含量除玉米浆为体积百分含量外，其余均为质量百分含量。所述玉米粉或玉米淀粉的质量百分含量优选为1.5％-2.0％，蛋白质含量≥40％的玉米浆的体积百分含量优选为5.0％-5.5％。为了提高环糊精葡萄糖基转移酶的产量，所述发酵培养基还包括质量百分含量为0.2％的K2HPO4，质量百分含量为0.02％的MgSO4·7H2O。所述发酵的起始pH为8.5-9.5，优选为8.6-9.2，可用Na2CO3调节。所述嗜碱芽孢杆菌HA-1 CGMCC № 1278的培养温度可为27℃-29℃。所述发酵的通气量可为0.8-1.2m3/m3/min，优选为1m3/m3/min。本专利技术的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278产酶水平高、发酵时间短，且产酶具有传代稳定性，10L发酵罐中发酵24h产酶活力(酶产量)可达到6100U/ml(是原始出发菌株的2倍以上)；5000L发酵罐中发酵20.5h产酶活力可达到6875U/mL。本专利技术的方法及其专用菌株将在环糊精葡萄糖基转移酶的生产中发挥重要作用，具有广阔的工业应用前景。具体实施例方式下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法；所提到的百分含量如无特别说明均为质量百分含量。实施例1、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)HA-1 CGMCC № 1278的获得培养基平板分离及斜面培养基(％)可溶性淀粉2％；聚蛋白胨0.5％；酵母浸膏0.5％；K2HPO40.1％；MgSO4·7H2O0.02％；琼脂3％；灭菌后加入无菌Na2CO3调pH至8.5-9.5。发酵培养基2.5％玉米粉；5％(V/V)玉米浆(蛋白质的质量百分含量≥40％，购自新乡淀粉厂)；0.1％K2HPO4；0.02％MgSO4·7H2O；灭菌后加入无菌Na2CO3调pH至8.5-9.5。将固体培养基上生长36h的嗜碱芽孢杆菌C(购自郑州市医药科技开发中心)制成菌悬液，取0.1ml均匀涂布于灭菌的平皿，置于28℃培养箱中培养。挑单菌落于平面固体培养基上，待菌长出后，挑选相对菌小圈(淀粉水解圈)大的菌落制成菌悬液，取0.1ml均匀涂布于灭菌的平皿中心一薄层，无菌风干后立即进行诱变处理先进行γ-诱变(0.5Gy)，然后依次进行能量30kev剂量如下的氮离子注入诱变2×1015个氮离子/cm2、1×1015个氮离子/cm2、两轮5×1015个氮离子/cm2、2×1015个氮离子/cm2、1×1016个氮离子/cm2及5×1015个氮离子/cm2的氮离子注入诱变。注入后立即用无菌水洗脱菌斑，稀释(10-1-10-2)后涂皿，置于28℃培养箱中培养。挑单菌落于固体平板培养基上，待菌落长出后，视菌落周围透明圈(淀粉水解圈)的大小进行初筛，挑选相对菌小圈大的菌落接种于斜面，28℃培养1d后挖块接种于装有30ml发酵培养基的250ml三角瓶中，在200rpm摇床上发酵1-2d，测定发酵液酶活力，进行复筛。参照文献(张树政.酶制剂工业.北京科学出版社，1984.549)的方法测定酶活力，具体方法如下取10μl样品(对照不加样品)，加入0.2ml pH9.0的0.2M甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，0.2ml 0.2％马铃薯淀粉溶液(空白不加马铃薯淀粉溶液)，40℃反应10min后加入0.5ml 0.5M醋酸终止反应，加入3ml 0.005％碘液显色，在700nm处测定吸光值(A)，以吸光值下降10％的酶量为1个单位。计算公式 结果表明嗜碱芽孢杆菌C经自然分离得到的产酶活性(酶产量)较高的0-4菌株38h的产酶活性为2500U/mL，然后对该菌株进行γ-诱变，得到的产酶活性较高的02-1-29菌株40h的产酶活性为3633U/mL；再对02-1-29菌株进行能量为30kev，剂量2×1015个氮离子/cm2的离子诱变，得到的产酶活性较高的02-2-500菌株41h的产酶活性为7129U/mL；再对02-2-500菌株进行能量为30kev，剂量1×1015个氮离子/cm2的离子诱变，得到的产酶活性较高的02-3-209菌株46h的产酶活性为4067U/mL；再对02-3-209菌株进行能量为30kev，剂量5×本文档来自技高网...

【技术保护点】
嗜碱芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＨＡ－１ＣＧＭＣＣ№１２７８。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王雁萍，秦广雍，段宇珩，许平辉，陈林海，李宗伟，苏明杰，谈重芳，李宗义，霍裕平，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]