一种酶法生产大元环糊精的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法生产大元环糊精的方法，属于环糊精生产技术领域。本发明专利技术是利用4‑α‑糖基转移酶以天然淀粉为底物生产大元环糊精，填补了该技术领域内的空白，为大元环糊精大规模的生物法生产奠定了基础；本发明专利技术方法总的反应周期短，只需要12小时；具有生产成本低、产品纯度高、工艺流程简单、生产周期短等诸多优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶法生产大元环糊精的方法，属于环糊精生产

技术介绍
环糊精(cyclodextrin，CD)是由不同数量的α-1,4糖苷键连接而成的环状糊精，常见的是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，其聚合度分别为6、7、8；而大元环糊精(Cycloamylose,大元环糊精)，是指聚合度从9至几百不等的环状糊精，也被称为大环-环糊精。由于大元环糊精的聚合度较高，且粘度低、水溶性好、并不易回生，其在结构与性质上区别于低聚合度的α-、β-和γ-环糊精。常见的环糊精形成类似于桶状的空腔结构，聚合度较小的大元环糊精形成一个独立的环；当大元环糊精聚合度较大时，成环的情况复杂，其大小和结构差异较大，当大元环糊精聚合度上升到一定程度时，会形成两个环状的疏水空腔结构。大元环糊精具有大小不一、结构各异的疏水空腔，这些疏水通道类似于直链淀粉分子的V-型螺旋通道。大元环糊精的环状结构可以随着客体分子、溶剂的变化发生改变，存在不稳定性和多变性，可用于包合成分复杂、分子大小各异的混合物。常见的α-、β-和γ-环糊精在大量使用时具有一定的毒性，使其在相关领域的应用受到限制。而目前的研究报道，还没有发现大元环糊精的毒性。因此，大元环糊精在生物、食品、医药、化学工业等领域前景可观。大元环糊精制作成本高，价格昂贵，其制备方法主要包括酶法合成和化学合成。Wakao等以麦芽三糖为初始反应底物，通过邻二酰桥分子固定技术，经过26步，合成聚合度为9的大元环糊精，但是糖类物质的结构复杂性抑制了化学法合成大元环糊精的发展。目前尚未有利用4-α-糖基转移酶酶法合成单一聚合度大元环糊精的报道，也没有能与大元环糊精混合物中的单一聚合度大元环糊精特异性结晶沉淀的有机溶剂。Terada Y等成功重组表达了来自Thermus aquaticus ATCC 33923的4-α-糖基转移酶基因，证并以0.02％(w/v)的合成直链淀粉为底物制备大元环糊精，转化率在90％左右；许燕等利用该酶并以1％(w/v)的高直链玉米淀粉为底物，经异淀粉酶脱支预处理后，将大元环糊精转化率由24.6％提高到45.6％。目前酶法制备大元环糊精主要问题在于：一、用于制备大元环糊精的4-α-糖基转移酶的报道并不多，主要集中在重组表达新的基因，并研究其酶学性质和晶体结构方面，关于其应用研究较少，且酶的重组表达量有待提高；二、缺少大元环糊精相应的生产工艺，底物直链淀粉价格昂贵，天然淀粉为底物制备大元环糊精转化率较低。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是提供了一种生物法生产大元环糊精的工艺，降低了大元环糊精的生产成本。本专利技术采用4-α-糖基转移酶生产大元环糊精，(1)按照1％-10％的浓度进行淀粉调浆，在70℃条件下搅拌10-15分钟；(2)设定反应温度65-70℃，调pH5.0-7.0，以每克淀粉计，分别加入30-70个单位的4-α-糖基转移酶、30-70个单位的普鲁兰酶，反应12小时左右；(3)采用无水乙醇沉淀方法得到大元环糊精。所述淀粉为马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉。在本专利技术的一种实施方式中，所述4-α-糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)按照1％-10％的浓度进行淀粉调浆，并按照每克淀粉0.25个单位的比例加入4-α-糖基转移酶，在70℃条件下搅拌10-15分钟。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)按照1％的浓度进行淀粉调浆。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)设定反应温度65℃。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)调pH5.5。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)以每克淀粉计，分别加入50个单位的4-α-糖基转移酶、50个单位的普鲁兰酶。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)采用无水乙醇沉淀方法得到大元环糊精的步骤是待反应结束后，取酶反应液上清，加入8-10倍体积的无水乙醇，离心得到无水乙醇与大元环糊精形成的络合物沉淀，将得到的沉淀于60℃烘箱中放置过夜，即得大元环糊精结晶。在本专利技术的一种实施方式中，所述4-α-糖基转移酶的制备是在一定培养条件下，通过微生物发酵一定时间，得到发酵液，发酵液经过离心得到菌体，菌体复溶后经超声破碎得到4-α-糖基转移酶粗酶液。本专利技术是根据4-α-糖基转移酶以及产物大元环糊精的特点生产大元环糊精的工艺，相对于现有技术，具有以下优点：1)提供一种低成本的以天然淀粉为底物的大元环糊精的生产方法，填补了该
内的空白，为大元环糊精大规模的生物法生产奠定了基础；2)本反应总的反应周期短，只需要12小时；总体来讲，本专利技术具有生产成本低、产品纯度高、工艺流程简单、生产周期短等诸多优点。具体实施方式4-α-糖基转移酶活力的测定法：分别取0.25mL的0.5％的可溶性淀粉溶液、0.05mL的1％麦芽糖溶液和0.6mL 50mM pH 5.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液于试管中，70℃水浴预热
10min。加入0.1mL稀释的酶液，震荡混匀，70℃反应10min，沸水浴15min终止反应。向上述反应体系中加入10mL碘液(0.2％KI+0.02％I2)，混匀，在620nm下测量其吸光值。酶活单位定义：在酶活测量体系下，每分钟降解1mg/ml淀粉所需的酶量。大元环糊精的分析采用高效液相色谱法色谱条件：日立Hitachi色谱仪，SuperMultipore PW-N(6.0mm×150mm)凝胶色谱柱，日立L-2490示差检测器，流动相0.05mM pH 7.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，流速0.3mL/min；柱温设定为50℃。处理样品时，沸水浴30min灭酶，在反应液中按照每克淀粉50个单位的比例加入Rhizopus sp.来源的糖化酶、Thermobifida fusca来源的异淀粉酶和Bacillus deramificans来源的普鲁兰酶，充分混匀后在40℃水浴摇床中反应10h；反应结束后，沸水浴30min灭酶，将反应液12000r/min离心10min，取上清，经过滤膜过滤(0.45μm)后用HPLC分析。实施例1 4-α-糖基转移酶突变体的制备及表达根据NCBI上的TaAM氨基酸序列(NCBI编号：GI:6225654)，设计引物，以购买的Thermus aquaticus ATCC 33923基因组为模板，通过PCR扩增获得TaAM基因片段。正向引物：5′-GGGTTTCATATGGAGCTTCCCCGCGCTTTC-3′，反向引物：5′-CGGCCGGAATTCCTAGAGCCGTTCCGTGGC-3′，PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，模板DNA 1μL，DNA Polymerase 0.5μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃120s)；72℃继续延伸10min。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET24a(+)。将pET24a(+)质粒和TaAM基因分别进行Nde I和Hind III双酶切，酶切产物经胶回收后，用T4连接酶连接过夜，连接产物转化至本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产大元环糊精的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)按照1％‑10％的浓度进行淀粉调浆，在70℃条件下搅拌10‑15分钟；(2)设定反应温度65‑70℃，调pH5.0‑7.0，以每克淀粉计，分别加入30‑70个单位的4‑α‑糖基转移酶、30‑70个单位的普鲁兰酶，反应12小时左右；(3)采用无水乙醇沉淀方法得到大元环糊精；所述淀粉为马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉；所述4‑α‑糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种生产大元环糊精的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)按照1％-10％的浓度进行淀粉调浆，在70℃条件下搅拌10-15分钟；(2)设定反应温度65-70℃，调pH5.0-7.0，以每克淀粉计，分别加入30-70个单位的4-α-糖基转移酶、30-70个单位的普鲁兰酶，反应12小时左右；(3)采用无水乙醇沉淀方法得到大元环糊精；所述淀粉为马铃薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉；所述4-α-糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)按照1％-10％的浓度进行淀粉调浆，并按照每克淀粉0.25个单位的比例加入4-α-糖基转移酶，在70℃条件下搅拌10-...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，宿玲恰，朱荣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32