氨基葡萄糖苷抗性基因的应用制造技术

本发明专利技术涉及氨基葡萄糖苷抗性基因用于实现动物细胞的高密度生长的应用。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术的蛋白质表达领域。特别涉及氨基葡萄糖苷抗性基因，尤指新霉素抗性基因，在实现动物细胞的高密度生长中的应用，以及蛋白质生产方法及高密度细胞培养物。生物技术上以动物细胞培养方式生产治疗用蛋白质是一项非常费力且昂贵的工作。包括下游加工之生产效率主要系受到最初细胞培养步骤之空间-时间产率支配。自当希望同时使培养物肉汤中之产物蛋白达到高产率及高浓度。结果，在进入工业规模细胞培养之生产稳定期前使最大细胞密度达到较少量增加，将可希望使总产量增加，此仅因为于此方式中加入大量细胞总数。强硬地视细胞种类及培养方法而定，习知适用于高密度生长之补料-分批培养系统例如气升式反应器并无法使生长中不含血清的细胞培养物达到或甚至高于107细胞/毫升的密度。有可能于补充血清之补料-分批培养系统或于最近之灌输反应器系统中达到较高密度。但是，该二种选择皆留下严重的缺点。经补充以胎牛血清的培养基包含所有天然生长促进物质，其强烈依赖血清来源品质且(最重要的)具有无心地将动物病毒导入生产供医疗应用之治疗性蛋白质的培养物中的永久性危机。因此基于调节性理由，须避免血清补充。然而，灌输反应器系统较习知补料分批培养系统更为复杂，并需要在操作期间加以控制且在操作上更昂贵。此系由于必须永久灌输新鲜培养基，其需要最新式微过滤系统以供自该反应器平行释出培养基。若过滤单元受细胞碎片或蛋白质阻塞，则易使操作过程发生提早停滞的危险。比较上，补料分批培养在制程经济学及耐用性方面具有显著优势。而且，产生可制造所兴趣蛋白质之稳定重组细胞株，需要导入至少一种通常被固有表达的抗性标记基因。此类标记基因之表达可能对细胞造成最好不会冲击其生长行为的额外负担，其或甚至在富含血清补充的细胞培养基中亦可能有害地影响生长速率及最大存活细胞密度(Gaigle等，1999，氨基葡萄糖苷抗生素磷酸转移酶亦为丝氨酸蛋白质激酶Aminoglycoside antibiotic phosphotransferases are alsoserine protein kinases，Chemistry and Biology 6，11-18；Maio等，1991，人类巨噬细胞及表达氨基葡萄糖苷抗生素磷酸转移酶活性之畸胎癌细胞系中由蛋白质激酶C所介导的基因活化Gene activation mediated by protein kinase Cin human macrophage and teratocarcinoma cells expressing aminoglycosidephosphotransferase activity，J.Cell.Physiology 149，548-559；Southern等，1982，哺乳细胞于SV40早期区域启动子调控下经细菌基因转化成具抗生素抗性Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with abacterial gene under control of the SV40 early region promoter，J.Mol.Appl.Genet.1，327-341)。本专利技术的目的在于避免先前技术所产生之缺点，并提供一种使细胞于不含血清的培养系统中生长达高细胞密度的方法。此目的系通过于动物细胞中表达氨基葡萄糖苷抗性基因，其后将该等细胞培养于适当培养基及如权利要求1、2、8等独立所述的适宜培养系统中而实现。意外地，视习用于该项技术的培养方法及培养基而定，经根据本专利技术处理的细胞可于不含血清的细胞培养基中生长达到较其未经处理的亲本细胞系高出甚多之密度。此外，亦观察到稳定期生长有些许延长。以此方法，可于不含血清的培养基中达到最大存活细胞密度，其在本专利技术的前所无法理解的。本专利技术的可能实施方案显示于图示中。其中附图说明图1Neo-转化的NSO细胞在101补料分批气升式反应器系统中生长期间之存活细胞密度，与亲本及bcl-2转化细胞系的比较。图2Neo-转化的NSO细胞在101补料分批气升式反应器系统中生长期间所表达呈累加细胞时间之分泌抗体的产量，与bcl-2转化细胞系的比较。图3质粒图谱pEF-bcl-2图4质粒图谱pEF-Neo图5以NSO细胞系适应非致死剂量G418之比较性生长实验。图6Neo-转化的NSO细胞系之摇瓶分批培养及产量，与亲本及bcl-2转化细胞系的比较。根据本专利技术，氨基葡萄糖苷抗性基因产物系用于增进动物细胞的高密度生长。该项根据本专利技术的应用包含于细胞中表达该抗性基因产物，以其氨基葡萄糖苷会被该相对应抗性基因产物分解之氨基葡萄糖苷抗生素(优选以抗生素新霉素)检选出表达此类抗性基因产物的细胞，及最后于生物反应器例如气升式或搅拌型生物反应器中，于适宜不含血清的细胞培养基中将此类细胞活化以达高密度生长。根据本专利技术的抗性基因产物为任意氨基葡萄糖苷抗性标记，例如已知对庆大霉素、新霉素、潮霉素(且尤其是新霉素)的抗性基因，其可用做真核细胞之基因标记。氨基葡萄糖苷抗性基因一般用于真核细胞分子生物学中且经描述在许多标准教科书及实验手册中(例如，Shaw等，1993，氨基葡萄糖苷抗性基因之分子遗传学及氨基葡萄糖苷-修饰酵素之家族关系Molecular genetics of aminoglycosideresistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes，Microbiol.Rev.57138-163；WO 82/03087；Southern等，1982，哺乳细胞于SV40早期区域启动子调控下经细菌基因转化成具抗生素抗性Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance with abacterial gene under control of the SV40 early region promoter，J.Mol.Appl.Genet.1，327-341)。如上所推论得，氨基葡萄糖苷抗性基因产物以其根据本专利技术的氨基葡萄糖苷分解活性的观点而言，系一种功能性之基因产物。因此依上述概念，亦可将已知氨基葡萄糖苷抗性基因产物之经遗传工程改造所得的有义功能性变体用于本专利技术。此类变体可例如通过分别对胺基酸及其编码DNA序列进行取代、缺失、插入或截断而产生。此等方法为该项技术所熟知且通常包含定点突变或经由其随机突变产生多样性，然后再以功能分析之方式筛选得所希望的变体。用于产生突变之例行方法可为例如暴露至烷化剂或UV照射、进行易错PCR或相关之基因改组PCR技术，且通常在微生物中完成(Miller，J.，分子遗传学实验Experiments in Molecular Genetics，冷泉港实验室1972；Ling等，1997，DNA致变方法Approaches to DNA Mutagenesis，分析生物化学254，157-178；Cadwell等，1992，通过PCR致变作用之基因随机化于PCR方法Randomizationof genes by PCR mutagenesis i本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质表达法，其特征在于，所述方法包括将经氨基葡萄糖苷抗性基因转染且能够表达第二产物蛋白，优选为重组型产物蛋白，的动物细胞在不含血清的高密度生长培养基中生长至存活细胞密度达至少或高于１０↑［６］个细胞／毫升，优选为至少或高于１０↑［７］个细胞／毫升的步骤，并进一步包括将所述产物蛋白自该培养物肉汤单离的步骤。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：默罕穆德阿尔卢比尔，A皮拉尼，A拉切尔，J伯奇，
申请(专利权)人：英国龙沙生物医药股份有限公司，默罕穆德阿尔卢比尔，
类型：发明
国别省市：GB[英国]