本发明专利技术涉及T细胞治疗肿瘤的技术领域，具体涉及一种含抗PD‑1基因和聚亚精胺的复合物及其在治疗肿瘤中的应用；所示复合物包括质量比为1～100：1的聚亚精胺聚合物和抗PD‑1基因。所述复合物通过体外转染到T细胞，制备出自带分泌抗PD‑1抗体‑T细胞，能产生PD‑1抗体，从而帮助阻断PD‑1信号可有效帮助衰竭T细胞，促进抗肿瘤免疫应答的T细胞治疗肿瘤。与现有技术相比，本发明专利技术的分泌抗PD‑1抗体‑T细胞可有效治疗肿瘤，可实现肿瘤的免疫治疗，并且，不存在体内毒性的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤治疗的
，特别涉及一种含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物及其在治疗肿瘤中的应用，具体涉及一种将抗PD-1(programmeddeath-1)基因与聚亚精胺形成的纳米复合物通过体外转染到T细胞，制备自带分泌抗PD-1抗体-T细胞，能产生PD-1抗体，从而帮助阻断PD-1信号，可有效帮助衰竭T细胞，促进抗肿瘤免疫应答的T细胞治疗肿瘤的方法。
技术介绍
T淋巴细胞靶向杀伤表达这一特异抗原的肿瘤细胞。因其具有靶向杀伤肿瘤细胞的特点，CTL疗法已成为肿瘤个体化治疗的理想方案,在国际上越来越受到免疫学家们的重视。但是由于PD-1的产生导致T细胞失去活性。为了解决这一难题我们提出了在体外直接将抗PD-1的基因导入体细胞，从而T细胞自身产生抗PD-1的抗体，来提高T细胞的活性，起到治疗肿瘤的作用。基因因其独特的靶点特异性、结构可设计性和代谢安全性，成为科研界普遍看好的新的治疗药物。然而，在过去的20年里，研究人员设计了一系列的载体用于基因的体内输送，但仅有极少数进入临床阶段，迄今，仍未有一个载体得到FDA认证，一个有效载体的缺位，导致核酸物质体内输送仍然处于临床瓶颈期。将核酸物质输送到靶细胞的胞浆或细胞核内，需要克服一系列的体内输送屏障，因此，核酸载体是否高效，是其能否用于临床治疗的关键所在。核酸物质输送的载体一般为以下两类：(1)病毒载体：病毒载体(如慢病毒载体、腺病毒载体)作为基因的输送载体，虽然有较高的体外转染活性，然而，其免疫原性与易导致突变的缺点为临床试验带来了巨大的安全问题，使得其应用受限。(2)非病毒载体：非病毒载体的优势主要在于，在保证预期的转染活性的条件下，可以大大降低病毒载体所带来的免疫原性与诸多炎症反应，其一般为以下两种载体设计：(a)阳离子脂质体；(b)聚阳离子基因载体。而目前研究更多的主要集中于聚阳离子基因载体与阳离子脂质体的修饰，使之适用于基因物质的靶向输送。阳离子脂质体具有较高的体内外转染活性，然而，由于表面的正电荷影响其体内的正常分布，同时，由于选用阳离子脂质，免疫原性与炎症反应在动物试验中也成为不可避免的缺点之一(Gao,K.&Huang,L.NonviralmethodsforsiRNAdelivery.Molecularpharmaceutics6,651-658(2008).)。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物及其在治疗肿瘤中的用途。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：第一方面，本专利技术提供了一种含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物，所述复合物包括质量比为1～100：1的聚亚精胺聚合物和抗PD-1基因。优选地，所述聚亚精胺聚合物和抗PD-1基因的质量比为5～50：1。优选地，所述聚亚精胺聚合物和抗PD-1基因的质量比为10～30：1。优选地，所述聚亚精胺聚合物为亚精胺与连接剂形成的聚阳离子聚合物。优选地，所述连接剂为戊二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛、邻苯二甲醛、2,5-咪唑二甲醛、2,4-吡啶二甲醛、2,5-吡啶二甲醛、2,6-吡啶二甲醛、2,5-哒嗪二甲醛或2,6-哒嗪二甲醛中的一种。第二方面，本专利技术提供了一种含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物的制备方法，包括以下步骤：所述聚亚精胺聚合物的水溶液和抗PD-1基因的水溶液混合，在室温静置20-60分钟即可制得所述复合物。第三方面，本专利技术提供了一种含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物的在治疗肿瘤中的应用。第四方面，本专利技术提供了一种利用含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物治疗肿瘤的方法，包括以下步骤：将所述含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物与T细胞共培养，制备自带分泌抗PD-1抗体-T细胞，再将自带分泌抗PD-1抗体-T细胞注射到肿瘤病人体内即可。与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1、本专利技术的分泌抗PD-1抗体-T细胞可有效治疗肿瘤，可实现肿瘤的免疫治疗，并且，不存在体内毒性的问题。2、本专利技术制备的含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物转染T细胞治疗肿瘤的方法，可实现抗PD-1基因高效低毒的输送，由于亚精胺是体内专职凝聚基因的功能，从而有效提高转染效果。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为本专利技术的复合物的粒径示意图；图2为本专利技术的复合物的zeta电位示意图；图3为本专利技术的复合物的透射电镜示意图；图4为本专利技术的复合物的凝胶电泳示意图；图5为本专利技术的聚亚精胺聚合物的细胞毒性示意图；图6为小鼠肿瘤模型及肿瘤组织切片的示意图；其中，图A-D为取下的肿瘤组织，A为生理盐水组的肿瘤；B为裸DNA组的肿瘤；C为聚亚精胺聚合物(PSAi)组的肿瘤；D为本专利技术的纳米复合物组的肿瘤。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。以下实施例提供了一种含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物，所述复合物包括质量比为1～100：1的聚亚精胺聚合物和抗PD-1基因。所述聚亚精胺聚合物和抗PD-1基因的质量比为5～50：1。所述聚亚精胺聚合物和抗PD-1基因的质量比为10～30：1。所述聚亚精胺聚合物为亚精胺与连接剂形成的聚阳离子聚合物。所述连接剂为戊二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛、邻苯二甲醛、2,5-咪唑二甲醛、2,4-吡啶二甲醛、2,5-吡啶二甲醛、2,6-吡啶二甲醛、2,5-哒嗪二甲醛或2,6-哒嗪二甲醛中的一种。所述含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物的制备方法，包括以下步骤：所述聚亚精胺聚合物的水溶液和抗PD-1基因的水溶液混合，在室温静置20-60分钟即可制得所述复合物。所述含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物的在治疗肿瘤中的应用。所述利用含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物治疗肿瘤的方法，包括以下步骤：将所述含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物与T细胞共培养，制备自带分泌抗PD-1抗体-T细胞，再将自带分泌抗PD-1抗体-T细胞注射到肿瘤病人体内即可。实施例1聚亚精胺聚合物(PSAi)和抗PD-1质粒DNA的形成复合物的制备将聚亚精胺与连接剂2,6-吡啶二甲醛制备的聚亚精胺聚合物配成水溶液，浓度为2μg/μl，用灭菌水稀释成20ng/μl、40ng/μl、100ng/μl、200ng/μl、1000ng/μl和2000ng/μl溶液。另外将抗PD-1基因质粒DNA配成水溶液，浓度为20ng/μl。将聚亚精胺聚合物水溶液等体积加入至质粒DNA水溶液，涡旋5min，并静置20min，即得一系列纳米复合物的溶液。实施例2聚亚精胺聚合物(PSAi)和抗PD-1质粒DNA的形成复合物的粒径与电位的表征将实施例1制备的一系列复合物溶液放入BIC90plus粒度电位分析仪的测试槽中，该一系列复合物溶液的复合物中PSAi与质粒DNA的质量比0.25、0.5、2、5、10、50，设置测试温度为25℃，介质为水，粘度为0.89cp，折射率为1.330，光散射角度为90。，检测波长为659nm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含抗PD‑1基因和聚亚精胺的复合物，其特征在于，所述复合物包括质量比为1～100：1的聚亚精胺聚合物和抗PD‑1基因。
【技术特征摘要】
1.一种含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物，其特征在于，所述复合物包括质量比为1～100：1的聚亚精胺聚合物和抗PD-1基因。2.如权利要求1所述的含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物，其特征在于，所述聚亚精胺聚合物和抗PD-1基因的质量比为5～50：1。3.如权利要求2所述的含抗PD-1基因和聚亚精胺的复合物，其特征在于，所述聚亚精胺聚合物和抗PD-1基因的质量比为10～30：1。4.如权利要求1-3任一项所述的含抗PD-1基因和聚阳离子的复合物，其特征在于，所述聚亚精胺聚合物为亚精胺与连接剂形成的聚阳离子聚合物。5.如权利要求4所述的含抗PD-1基因和聚阳离子的复合物，其特征在于，所述连接剂为戊二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛、邻苯二甲醛、2,5-咪唑二甲醛、2,...
【专利技术属性】
技术研发人员：马孟，
申请(专利权)人：上海云舜生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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