ALS突变型基因及其蛋白在抗除草剂方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种ALS突变型基因，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C、第339位核苷酸由A变成核苷酸C、第1099碱基C变成T和第1880碱基G变成A。本发明专利技术还公开了一种ALS突变型基因所编码的ALS蛋白及其应用。该蛋白来源于抗ALS抑制剂类除草剂的水稻突变体植株，与水稻野生型ALS序列相比，其蛋白序列在Gln25、Gln113、His367和Ser627位点突变。绿色植物表达该蛋白序列可以抗（耐）乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂，特别是咪唑啉酮和磺酰脲类除草剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物蛋白和植物抗除草剂领域。具体而言，本专利技术涉及水稻的乙酰乳酸合成酶(ALS)突变蛋白，该蛋白能赋予植物尤其水稻抗乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂的特性。本专利技术公开了该蛋白的序列，以及它们在植物抗除草剂领域中的应用。
技术介绍
杂草是制约农业生产稳产高产的不利因素。与传统依靠栽培措施、人工除草和机械除草等方法相比，化学除草剂的使用是一种高效的、简便的和经济的治理杂草方法。乙酰乳酸合成酶(ALS)(也称乙酰羟酸合成酶，AHAS；EC4.1.3.18)抑制剂类除草剂以ALS作为靶标而导致杂草死亡，主要包括磺酰脲类(Sulfonylureas,SU)、咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMI)、三唑嘧啶类(Triazolopyrimidines,TP)、嘧啶氧(硫)苯甲酸类[Pyrimidinylthio(oroxy)–benzoates,PTB；pyrimidinyl-carboxyherbicides；PCs]和磺酰胺基羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones,SCT)等13类化合物。ALS抑制剂类除草剂具有选择性强、杀草谱广、低毒高效等特点，目前已大面积推广使用。但这些除草剂对一般不具有抗(耐)除草剂特性的农作物本身也产生药害，极大限制了其使用时间和使用空间，如需要在农作物播种前一段时间使用除草剂才能避免农作物遭受药害。培育抗(耐)除草剂作物品种可减少作物药害、拓宽除草剂的使用范围。成熟的ALS蛋白大约由670个氨基酸组成，其序列在不同物种间高度保守。ALS蛋白在Gly95、Ala96、Ala122、Pro171、Pro196、Pro197、Ala205、Asp376、Trp537、Trp548、Trp552、Trp557、Trp563、Trp574、Ser621、Ser627、Ser638、Ser653、Gly654、Val669等氨基酸位点(以模式植物拟南芥的ALS氨基酸位置计算)发生突变可以产生ALS抑制剂类除草剂抗性，这在多种农作物(包括玉米、小麦、水稻、油菜、向日葵等)、模式植物拟南芥和上百种杂草中均有报道。其中，水稻已知的抗ALS抑制剂突变位点包括Gly95、Ala96、Ala122、Trp548、Ser627、Ser653和Gly654。ALS突变体抗除草剂水平与ALS氨基酸突变的位置有关，还与突变后的氨基酸种类及突变氨基酸的数目有关。目前，ALS抑制剂类除草剂的作用机理尚未确定，很难提前预测ALS蛋白其它氨基酸位点的突变是否会产生除草剂抗性，只能依赖于科研人员长期、艰苦的实践探索，并凭借一些运气才可能发现ALS蛋白新的除草剂抗性位点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供一种ALS突变型基因。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述ALS突变型基因所编码的ALS蛋白。本专利技术还要解决的技术问题是提供了含有上述的ALS突变型基因的表达盒、重组载体或细胞。本专利技术还要解决的技术问题是提供了上述ALS突变型基因、蛋白、表达盒、重组载体或细胞在制备绿色植物除草剂方面的应用。本专利技术还要解决的技术问题是提供了获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供了鉴定具有除草剂抗性的绿色植物的方法。本专利技术人通过长期、艰苦的研究，对籼稻优良恢复系9311的EMS突变植株进行长期、不断地筛选，发现了一系列ALS突变蛋白，包括前文所述的某些已知ALS突变蛋白和新ALS突变蛋白，其对ALS抑制剂类除草剂不敏感，从而使得植物具有ALS抑制剂类除草剂抗性。本专利技术在植物育种中的应用，可用于培育具有除草剂抗性的植物，尤其是农作物，还开发了这些蛋白及其编码基因在转基因或者非转基因如水稻等作物中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种ALS突变型基因，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C、第339位核苷酸由A变成核苷酸C、第1099碱基C变成T和第1880碱基G变成A。上述ALS突变型基因其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。上述的ALS突变型基因所编码的ALS蛋白。该突变来源于水稻，与对ALS抑制剂类除草剂敏感的野生型水稻ALS(如Genbank登录号BAB20812.1)相比，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C、第339位核苷酸由A变成核苷酸C、第1099碱基C变成T和第1880碱基G变成A，导致其相应编码的氨基酸序列的第25位氨基酸由谷氨酰胺变为组氨酸、第113位氨基酸由谷氨酰胺变为组氨酸、第367位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸、第627位氨基酸由丝氨酸变为天冬酰胺，目前还没有报道表明，在来自水稻的ALS的Gln25、Gln113、His367和Ser627位点突变，会使得水稻具有ALS抑制剂类除草剂抗性。上述的ALS蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。本
技术实现思路
还包括表达盒、重组载体或细胞，其含有上述的ALS突变型基因。本
技术实现思路
还包括上述的ALS突变型基因、蛋白、表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。上述绿色植物为水稻、烟草、拟南芥、棉花等。本
技术实现思路
还包括获得具有除草剂抗性的绿色植物的方法，包括如下步骤：1)使绿色植物包含所述的ALS突变型基因；或2)使绿色植物表达所述的ALS蛋白。上述的方法，包括转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。鉴定权利要求上述的方法获得的绿色植物的方法，包括以下步骤：1)测定所述绿色植物是否包含上述的ALS突变型基因；或，2)测定所述绿色植物是否表达上述的ALS蛋白。有益效果：田间喷施ALS抑制剂类除草剂“百垄通”的实验结果表明，含有本专利技术的ALS突变蛋白的水稻(突变植株3也就是9311M3)3-4叶幼苗在施用3mL百垄通/L水(9倍推荐使用浓度)后，植株仍然正常生长发育和结实，而野生型水稻3-4叶幼苗在施用1mL百垄通/3L水(1倍推荐使用浓度)30天后表现为整株死亡。附图说明图1百垄通除草剂筛选获得的抗性水稻突变体；图2PCR扩增ALS基因5’端结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为5kb、3kb、2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp，第2泳道为9311野生型水稻DNA，第3～12泳道为抗除草剂突变植株3的DNA；目的片段长度1162bp；图3PCR扩增ALS基因3’端结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为5kb、3kb、2kb、1kb、750b本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ALS突变型基因，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C、第339位核苷酸由A变成核苷酸C、第1099碱基C变成T和第1880碱基G变成A。

【技术特征摘要】
1.一种ALS突变型基因，其在水稻的ALS基因序列的第75位核苷酸由G变成核苷酸C、第
339位核苷酸由A变成核苷酸C、第1099碱基C变成T和第1880碱基G变成A。
2.根据权利要求1所述的ALS突变型基因，其特征在于，所述ALS突变型基因其核苷酸序
列如SEQIDNo:1所示。
3.权利要求1或2所述的ALS突变型基因所编码的ALS蛋白。
4.根据权利要求3所述的ALS蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
5.表达盒、重组载体或细胞，其含有权利要求1或2所述的ALS突变型基因。
6.权利要求1或2所述的ALS突变型基因、权利要求3或4所述的蛋白，权利要求5所述的
表达盒、重组载体或细胞在绿色植物抗除草剂方面的应用。
7.根据权利要求6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张保龙，陈天子，王金彦，凌溪铁，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32