本发明专利技术属于转基因植物检测领域，具体公开了用于鉴定双价抗除草剂基因棉花品系GGK2及其衍生系的特异的2个分子标记，该分子标记分别由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。本发明专利技术还公开了用于扩增分子标记的特异性引物，以及本发明专利技术分子标记和特异性引物的用途。本发明专利技术为双价抗除草剂基因棉花品系GGK2或其衍生材料的检测鉴定提供了准确、可靠的分子标记和特异性引物，为转基因安全提供了保证；其次，本发明专利技术检测方法简单、检测速度快，适宜于在转基因作物遗传育种中对杂交后代中对双价抗除草剂基因的纯合/杂合体育种材料进行大规模地进行鉴定和筛选，有助于缩短育种进程，降低育种成本。
【技术实现步骤摘要】
鉴定双价抗除草剂基因棉花GGK2分子标记及应用
本专利技术属于转基因植物鉴定领域，具体涉及鉴定双价抗除草剂基因棉花GGK2的分子标记，以及该分子标记的用途。
技术介绍
杂草严重威胁着棉花的产量和品质.一方面它和棉花争夺光、水和养分,另一方面作为农作物病虫害的中问寄主,传播病虫害。我国棉花栽培中人工除草成本为3000元/公顷，通过将抗除草剂基因导入棉花使棉花品种获得抗除草剂性状，再利用除草剂进行除草，不仅每年可使我国棉农减少投入亿元以上，而且对提高棉花产量和品质、降低棉花生产成本、增加棉农收入具有重要意义。草甘膦(英文名：Glyphosate；化学式：C3H8NO5P；化学名称：N-(膦酸甲基)甘氨酸；商品名：农达(Roundup)镇草宁、草干膦、膦甘酸等)是美国孟山都公司(Monsanto)开发的一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，其毒性机制主要是竞争性抑制莽草酸途径中的EPSPS合酶，导致莽草酸途径中断，芳香族氨基酸合成受阻，从而扰乱生物体的正常氮代谢，最终导致生物体死亡。草甘膦具有结构简单、生产成本低、除草效果好、低毒无残留等优点，是目前世界上使用面积最广的除草剂品种。但作为一种非选择性除草剂，它对农作物同样具有灭生性作用，这大大限制了草甘膦在农业生产中的应用范围。为在农业生产中使用草甘膦，须培育具有草甘膦抗性或降解性质的农作物。抗草甘膦基因为天然存在于某些特定物种中的拮抗除草剂草甘膦的基因，该基因编码抗草甘膦酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，从而使草甘膦失去对菌类或植物的毒害作用。利用基因工程等手段，将抗草甘膦的Epsps基因转入植物体内培育抗草甘膦作物，对于作物控制杂草有着非常重要的生产意义。自从1976年美国孟山都公司的草甘膦类除草剂——农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用以来，作物抗草甘膦转基因研究成为抗除草剂基因工程研究的热点。目前，我国已有多个抗除草剂转基因棉花品系进入环境释放和生产试验阶段。对转基因作物的鉴定检测是对转基因作物进行有效监管的基础。对转基因作物成分的检测方法，主要有针对外源目的基因和调控元件检测的基因特异性检测方法，针对遗传转化载体的特征建立的载体特异性检测方法，针对外源DNA插入序列特征建立的转基因作物品系特异性检测方法等三类。其中转基因作物中外源DNA插入片段的侧翼序列是转基因作物最重要的分子标志物(DeBuckS等.PlantJ.2009；60.Doi：10.1111/j.1365-313X.2009.03942.x)。由于每个转基因作物品系，外源基因在受体基因组中的整合位点具有随机性，即相同的载体多次转化，整合的位置具有高度的特异性和不可重复性，因此，利用外源DNA插入的染色体位点的侧翼序列特异地鉴定转基因品种(品系)是目前鉴定转基因作物最可靠、最特异的检测方法，此方法能准确检测鉴定同一转化体及其衍生品系(HenselG等.BMCPlantBiology.12(1):1-11.doi:10.1186/1471-2229-12-171)。专利《基于外源基因旁侧序列鉴定转基因水稻吉生粳2号的方法》(申请号为：201510381819.1)公开了利用外源基因旁侧序列鉴定该转基因材料的方法。目前，在棉花生产中应用的主要是具有单价抗草甘膦基因的转基因棉花，其对草甘膦抗性相对较差，而专利申请《一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用》(申请号为：2014102047036)公开了一种含有GR79和GAT的双价抗草甘膦基因的转基因棉花，获得了更强的草甘膦抗性，具有巨大的应用价值。
技术实现思路
本专利技术人利用农杆菌介导法将专利申请《一种含有草甘膦抗性基因的表达载体及其应用》(申请号为：2014102047036)中所述的双价抗除草剂基因GR79和GAT导入棉花品系R18，从众多双价抗除草剂转基因事件中筛选到一个单插入D10染色体20274741～20274752位点的转基因事件，最终培育获得了抵抗草甘膦除草剂浓度最高可以达到8倍生产应用浓度的品系，其具有重要的应用价值，专利技术人将该品系命名为GGK2。以GGK2品系中外源插入片段及其侧翼序列为基础设计特异性引物和特异性探针，用于鉴定GGK2品系或其衍生系，从而形成本专利技术。本专利技术目的在于提供鉴定双价抗除草剂基因棉花的分子标记。本专利技术另一目的在于提供用于扩增上述分子标记的PCR引物。本专利技术第三目的在于提供上述分子标记在鉴定双价抗除草剂基因棉花上的用途。本专利技术第四目的在于提供上述引物在鉴定双价抗除草剂基因棉花上的用途。本专利技术第五目的在于提供利用上述分子标记鉴定双价抗除草剂基因棉花的方法。本专利技术第六目的在于提供利用上述分子标记培育双价抗除草剂基因棉花的方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术鉴定双价抗除草剂基因棉花的分子标记，所述的分子标记由分子标记1和分子标记2组成；其中所述的分子标记1由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列组成；所述的分子标记2由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列组成。上述分子标记，其中所述的分子标记1大小为955bp。上述分子标记，其中所述的分子标记2大小为1143bp。上述分子标记，其中用于扩增分子标记1的PCR引物对由SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的核苷酸序列组成；用于扩增分子标记2的PCR引物对由SEQIDNo:5和SEQIDNo:6所示的核苷酸序列组成；具体的引物序列如下：正向引物GR_F:5'CTACATTAAGGGTATATAGAAGTG3'(SEQIDNo:3)，反向引物NPT_R:5'GTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAG3'(SEQIDNo:4)；正向引物GAT_F:5'TTCACTCATTAAACACGCCGAAGAGATC3'(SEQIDNo:5)，反向引物GL_R:5'TTAGAGTCGAATACGGGGTTTTAC3'(SEQIDNo:6)。上述分子标记，其中所述的双价抗除草剂基因棉花是指GGK2、或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料，或者由它们作为亲本组配的杂交种。所述的双价抗除草剂基因是指GR79和GAT。所述的除草剂是指草甘膦。用于扩增上述分子标记的PCR引物，所述的PCR引物由2个引物对组成；其中1个引物对由SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的核苷酸序列组成；另一个引物对由SEQIDNo:5和SEQIDNo:6所示的核苷酸序列组成。上述分子标记在鉴定双价抗除草剂基因棉花上的应用。上述应用中所述的双价抗除草剂基因棉花是指GGK2、或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料，或者由它们作为亲本组配的杂交种。上述应用中所述的分子标记由分子标记1和分子标记2组成。上述应用中所述的分子标记，其中用于扩增分子标记的PCR引物由2个引物对组成；其中用于扩增分子标记1的引物对由PCR引物对由SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的核苷酸序列组成；用于扩增分子标记2的引物对由PCR引物对由SEQIDNo:5和SEQIDNo:6所示的核苷酸序列组成。上述引物在鉴定双价抗除草剂基因棉花上的应用。所述的引物由2个引物对组成，其中1个引物对由SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的核苷酸序列组成；另一个引物对由PCR引物对由S本文档来自技高网...
【技术保护点】
鉴定双价抗除草剂基因棉花的分子标记，其特征在于所述的分子标记由分子标记1和分子标记2组成；其中所述的分子标记1由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成；所述的分子标记2由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。
【技术特征摘要】
1.鉴定双价抗除草剂基因棉花的分子标记，其特征在于所述的分子标记由分子标记1和分子标记2组成；其中所述的分子标记1由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列组成；所述的分子标记2由SEQIDNO:2所示的核苷酸序列组成。2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于用于扩增分子标记1的PCR引物对由SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的核苷酸序列组成；用于扩增分子标记2的PCR引物对由SEQIDNo:5和SEQIDNo:6所示的核苷酸序列组成；具体的引物序列如下：正向引物GR_F:5'CTACATTAAGGGTATATAGAAGTG3'(SEQIDNo:3)，反向引物NPT_R:5'GTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAG3'(SEQIDNo:4)；正向引物GAT_F:5'TTCACTCATTAAACACGCCGAAGAGATC3'(SEQIDNo:5)，反向引物GL_R:5'TTAGAGTCGAATACGGGGTTTTAC3'(SEQIDNo:6)。3.根据权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于所述的双价抗除草剂基因棉花是指GGK2、或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料，或者由它们作为亲本组配的杂交种；其中所述的GGK2是将由GR79和GAT基因表达盒串联组成的T-DNA，以单插入位点的形式整合于棉花染色体上获得的转基因棉花品系；所述的插入位点为D10染色体20274741～20274752位置，插入位点侧翼序列为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；所述的T-DNA插入片段由NPTⅡ标记基因、GR79和GAT抗除草剂基因表达框串联组成。4.用于扩增权利要求1所述的分子标记的PCR引物，其特征在于所述的PCR引物由2个引物对组成；其中1个引物对由SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的核苷酸序列组成；另一个引物对由SEQIDNo:5和SEQIDNo:6所示的核苷酸序列组成。5.权利要求1所述的分子标记在鉴定双价抗除草剂基因棉花上的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的双价抗除草剂基因棉花是指GGK2、或含有相同双价抗除草剂基因的GGK2的衍生材料，或者由它们作为亲本组配的杂交种；其中所述的GGK2是将由GR79和GAT基因表达盒串联组成的T-DNA，以单插入位点的形式整合于棉花染色体上获得的转基因棉花品系；所述的插入位点为D10染色体20274741～20274752位置，插入位点侧翼序列为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；所述的T-DNA插入片段由NPTⅡ标记基因、GR79和GAT抗除草剂基因表达框串联组成。7.权利要求4所述的引物在鉴定双价抗除草剂基因棉花上的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述的双价抗除草剂基因棉花是指...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭三堆，林敏，张锐，孟志刚，孙豹，王远，孙国清，陆伟，张维，梁成真，朱涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，郭三堆，
类型：发明
国别省市：北京;11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。