【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及植物根尖稀有qc细胞类群单个细胞的制备方法及其应用。
技术介绍
1、静止中心是高等植物根尖分生组织的控制中心，位于细胞分裂区(分生组织区)和根冠区之间，由一群分裂缓慢的细胞所构成，该处的细胞基本上不发生分裂和分化，因此称为静止中心(quiescent center，qc)。1954年clowes在玉米根尖中发现，顶端分生组织中最中央区域细胞分裂频率很低或不分裂，利用放射自显影技术，在玉米、蚕豆、洋葱根尖中分生组织区中，有一个区域细胞几乎没有发生dna的合成，因而确定无细胞的分裂，被命名为静止中心。静止中心是高等植物根尖分生组织中一群重要细胞，在根尖生长点功能和干细胞的维持和调控中起关键作用，它们一方面提供维持干细胞特性所需的调控信号，如果任何一个静止中心细胞死亡或功能丧失，会导致与其直接接触的干细胞分化和失去干细胞特性。另一方面，当干细胞受损时静止中心细胞通过分裂补充新的干细胞，行使其干细胞修复功能。由于静止中心细胞在根干细胞及根尖分生组织调控中的重要作用，其自身的调控也是植物学研究，特别是植物发育学研究的一个重要对象。
2、转录组分析是将基因型与细胞表型联系起来的一种强有力的策略。随着分子生物学技术的飞速发展，人们对转录组学的研究不再局限于群体细胞水平，而是精确到单细胞水平。众所周知，生物组织所具有的普遍特征是细胞异质性。常规的多细胞水平的转录组学的研究需要大量细胞，并且其研究结果反应的是群体细胞基因表达的平均值，而这个平均值掩盖了数量较少的细胞亚群的表达信息，因而难以区分群体细胞中不同
技术实现思路
1、专利技术所要解决的技术问题是如何制备植物根尖稀有qc细胞类群单个细胞(植物根尖静止中心单细胞)和/或如何将所述单细胞应用于单细胞转录组测序技术。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种植物根尖静止中心单细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
3、a1)将植物根尖组织用酶解液和氧化锆珠在50～300rpm条件下进行酶解，得到酶解物；
4、a2)向所述酶解物中加入w5溶液处理，得到植物根尖静止中心单细胞悬液，通过显微操作获得植物根尖静止中心单细胞；
5、所述酶解液可由纤维素酶rs、半纤维素酶、离析酶r10、果胶酶y-23、甘露醇、cacl2、牛血清白蛋白、β-巯基乙醇、羧苄青霉素、吗啉乙磺酸和溶剂组成，所述w5溶液可由cacl2、nacl、kcl、吗啉乙磺酸(mes)和溶剂组成。
6、进一步地，所述氧化锆珠的直径可为1-5mm。
7、进一步地，所述氧化锆珠的直径可为2-4mm。
8、具体地，所述氧化锆珠的直径可为3mm。
9、进一步地，所述溶剂可为ddh2o。
10、上述方法中，所述氧化锆珠和所述酶解液的质量体积比可为：1～13g：10ml。
11、进一步地，所述氧化锆珠和所述酶解液的质量体积比可为：2～13、3～13、4～13、6～13、4～12或6～10g：10ml。
12、上述方法中，所述氧化锆珠和所述酶解液的质量体积比可为：8g：10ml。
13、上述方法中，所述50～300rpm为70～300rpm、70～250rpm、150～250rpm或200rpm。
14、上述方法中，所述酶解液的组成可为：15g/l纤维素酶rs、10g/l半纤维素酶、7.5g/l离析酶r10、5g/l果胶酶y-23、0.6mol/l甘露醇、1mmol/l cacl2、1g/l牛血清白蛋白(bsa)、体积百分含量为0.04％的β-巯基乙醇、50mg/l羧苄青霉素、0.01mol/l吗啉乙磺酸(mes)，所述溶剂为ddh2o。
15、上述方法中，所述w5溶液的组成可为：0.125mol/l cacl2、0.154mol/l nacl、0.005mol/l kcl、0.002mol/l吗啉乙磺酸(mes)，所述溶剂为ddh2o。
16、上述方法中，所述将植物根尖组织用酶解液进行酶解的条件还包括：在真空条件下酶解2小时。
17、上述方法中，所述将植物根尖组织用酶解液进行酶解的条件可为：将拟南芥种子接种于1/2ms培养基中，24℃光照培养(16h光照，8h黑暗)5天，用蓝吉列刀片将根尖3mm切成1mm的小段，置于盛有10ml酶解液的50ml圆底离心管，同时在酶解液中加入8g直径为3mm的氧化锆珠，酶解液全程避光。真空条件下24℃，200rpm，酶解2小时。
18、上述方法中，所述将植物根尖组织用酶解液进行酶解的条件可为：将水稻种子于37℃培养箱浸种萌发后，28℃光照培养(16h光照，8h黑暗)3天，用蓝吉列刀片将根尖切成1mm的小段，置于盛有10ml酶解液的50ml圆底离心管，同时在酶解液中加入8g直径为3mm的氧化锆珠，酶解液全程避光。真空条件下28℃，200rpm，酶解2小时。
19、上述方法中，向所述酶解物中加入w5溶液处理的方法可包括：向所述酶解物中加入等体积的所述w5溶液，进行过滤，收集滤液进行离心，收集沉淀，向所述沉淀中加入所述w5溶液弃上清，得到植物根尖静止中心单细胞。
20、进一步地，上述方法中，向所述酶解物中加入w5溶液处理的方法可为：在所述酶解后的混合物中加入等体积的w5溶液，用40微米筛子过滤，将滤液吸到圆底离心管中100g离心6min，弃上清，再加入w5溶液100g离心6min，加速度和减速度均为1g，弃上清，获根尖单细胞原生质体悬液，通过显微操作得到植物根尖静止中心单细胞。
21、上述方法中，所述植物可为wox5基因被进行荧光标记的转基因植物。
22、上述方法中，所述植物可为wox5基因被融合gfp基因的转基因植物。
23、本文所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。
24、本文所述植物可为拟南芥或水稻。
25、进一步地，所述转基因拟南芥可为arabidopsis thaliana哥伦比亚野生型背景，经wox5基因启动子驱动gfp基因被进行荧光标记的转基因植物。所述转基因水稻可为日本晴野生型背景，经oswox5基因启动子驱动gfp基因被进行荧光标记的转基因植物。...
【技术保护点】
1.一种植物根尖静止中心单细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化锆珠和所述酶解液的质量体积比为：1～13g：10mL。
3.根据权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于，所述氧化锆珠和所述酶解液的质量体积比为：8g：10mL。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述50～300rpm为70～300rpm、70～250rpm、150～250rpm或200rpm。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，所述酶解液的组成为：15g/L纤维素酶RS、10g/L半纤维素酶、7.5g/L离析酶R10、5g/L果胶酶Y-23、0.6mol/L甘露醇、1mmol/LCaCl2、1g/L牛血清白蛋白、体积百分含量为0.04％的β-巯基乙醇、50mg/L羧苄青霉素、0.01mol/L吗啉乙磺酸，所述溶剂为ddH2O。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于，所述W5溶液的组成为：0.125mol/L CaCl2、0.154mol/L NaCl、0
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于，所述将植物根尖组织用酶解液进行酶解的条件还包括：在真空条件下酶解2小时。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于，向所述酶解物中加入W5溶液处理的方法包括：向所述酶解物中加入等体积的所述W5溶液，进行过滤，收集滤液进行离心，收集沉淀，向所述沉淀中加入所述W5溶液弃上清，得到植物根尖静止中心单细胞悬液。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于，所述植物为WOX5基因被进行荧光标记的转基因植物。
10.权利要求1-9中任一所述的方法在单细胞转录组测序中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种植物根尖静止中心单细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化锆珠和所述酶解液的质量体积比为：1～13g：10ml。
3.根据权利要求1或2任一所述的方法，其特征在于，所述氧化锆珠和所述酶解液的质量体积比为：8g：10ml。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述50～300rpm为70～300rpm、70～250rpm、150～250rpm或200rpm。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于，所述酶解液的组成为：15g/l纤维素酶rs、10g/l半纤维素酶、7.5g/l离析酶r10、5g/l果胶酶y-23、0.6mol/l甘露醇、1mmol/lcacl2、1g/l牛血清白蛋白、体积百分含量为0.04％的β-巯基乙醇、50mg/l羧苄青霉素、0.01mol/l吗啉乙磺酸，所述溶剂为ddh...
【专利技术属性】
技术研发人员：谷晓峰，胡桂花，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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