本发明专利技术提供了一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂盒及其用途，该试剂盒包括用于检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因的试剂和工具，和用于检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白的试剂和工具。本发明专利技术将两种不同生物学检测机制的检测手段结合在一起，在大肠肿瘤和癌前病变的判读和诊断中产生了协同作用，极大地提高了大肠肿瘤和癌前病变的检出率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疾病诊断领域，涉及一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂盒及其用途，尤其涉及一种检出率大幅度提高的用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂盒及其用途。
技术介绍
大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。虽然在正常和高危人群中开展大肠癌早期检测可以有效提高早期大肠癌的检出率和患者的生存率，但现有检测技术的局限性和缺陷导致我国大肠癌发病率和死亡率持续居高不下，给患者和家庭带来了巨大的精神痛苦和经济负担。目前常用的诊断大肠癌的方法包括实验室检查、内镜检查以及活体组织检查和脱落细胞学检查。其中，实验室检查又主要包括检测血液中的肿瘤标识物和检测大便中的血液遗留成分。目前常用的通过检测大便来诊断大肠癌的方法是检测肿瘤出血后留在大便中的血液成分，如血红素或血红蛋白。由于出血量少，不能用物理方法辨别，通常需采用检测大便潜血的方法来检测。大便潜血(亦称便隐血)是指消化道少量出血，红细胞被消化破坏，粪便外观无异常改变，肉眼和显微镜下均不能证实的出血。检测大便潜血(FIT)的方法主要有两种，传统的方法是用化学反应方法检测血红素。由于血红蛋白中的亚铁血红素具有类似过氧化物酶的作用，能催化过氧化物酶并释放出新生态氧，将无色的受体氧化为显色的物质。具体来说，其又分为邻甲苯胺法、匹拉米洞法、无色孔雀绿法和硫酸甲氨基酚法等。由于此类方法能非特异性地检测动物中的血红素或血红蛋白，检测前对受试者的动物蛋白食品的饮食限制和要求很高，受试者顺应性差，如受试者配合不够会导致检测结果不可靠。另一种检测大便潜血方法是用免疫化学的方法检测大便中的人血红蛋白。由于抗体能特异性区别人血红蛋白和动物血红蛋白，因此没有检测前对受检者的动物蛋白食品的饮食限制和要求。但是，由于大便中的潜血是大肠肿瘤出血留在大肠腔粪便中的结果。因此，该类诊断方法有效实施的前提条件是大肠肿瘤必须有出血存在才能被检测到。但事实上并不是每一大肠肿瘤都有出血，而且其他原因导致的出血也会出现在大便中，因此导致通过检测大便潜血的方法来诊断大肠癌的检出率偏低、准确性偏差。血液中肿瘤标识物可分为两大类，蛋白质肿瘤标识物，如癌胚抗原(CEA)以及核酸类肿瘤标识物。癌胚抗原对检测大肠癌的灵敏性和特异性不尽如人意；较可靠的血液中的肿瘤标识物是核酸类肿瘤标识物，如近年来发现的甲基化的Septin9基因。血液中甲基化的Septin9基因是甲基化了的肿瘤抑制基因片段，其可以从大肠癌肿瘤细胞进入到血液中。在血液中检测到的甲基化的Septin9基因实际上反映的是大肠中有肿瘤的形成和存在。从分子生物学的机理来说，基因甲基化反应了在肿瘤发生的早期阶段基因水平的异常。肿瘤抑制基因被甲基化后，肿瘤抑制基因的功能受到影响，从而导致肿瘤的发生。肿瘤中Septin9基因的甲基化可能是大肠癌发生的主要机制之一。由于大肠癌中甲基化的Septin9基因可以经由非常复杂生物转运过程进入血液循环中，并可以通过分子检测方法检测到，所以检测血液中甲基化的Septin9基因的存在是一种检测早期大肠癌的方法。大肠癌血液中甲基化的Septin9基因检测也面临上述同样的问题，即并不是所有大肠癌都存在有甲基化的Septin9基因，也并不是所有大肠癌中的甲基化的Septin9基因可以经由非常复杂生物转运过程进入到血液中去，因此导致以检测血液中甲基化的Septin9基因的方法来诊断大肠癌的检出率也很有限。由此可见，目前存在的诸多大肠癌诊断方法都存在检出率和准确性有待于进一步提高的问题，亟需提供一种检出率和准确性更高的用于大肠肿瘤和/或癌前病变的预测和/或诊断的手段。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述缺陷，本申请提供了一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测方法、试剂盒及其用途。相对于已有的大肠肿瘤和/或癌前病变的预测和/或诊断手段而言，本专利技术将两种不同生物学检测机制的检测手段结合在一起，在大肠肿瘤和/或癌前病变预测和/或诊断过程中产生了协同作用，极大地提高了大肠肿瘤和/或癌前病变的检出率。具体地，本专利技术提供了一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测方法，该方法包括检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因和检测来自受试者大便样本中的血红素和/或血红蛋白。优选地，在上述方法中，所述检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因包括以下步骤：1、采集受试者的血液样本并制备血浆；2、抽提血浆中DNA并亚硫酸盐转化；3、采用PCR方法扩增甲基化的Septin9基因的DNA；4、采用甲基化的Septin9基因序列的特异性荧光素探针测定甲基化的Septin9基因序列。更优选地，在上述方法的步骤3中，所述PCR方法采用针对Septin9基因序列中不含CpG双碱基的区域来设计的PCR引物；更优选地，在上述方法的步骤3中，所述PCR方法采用针对Septin9基因序列中不发生甲基化而被亚硫酸盐转化的区域设计的阻断剂。更优选地，在上述方法的步骤4中，还包括通过计算机判读测定结果。本专利技术采用的PCR方法是在对常规的PCR方法的基础上进行优化得到的，优化后的PCR反应中采用了阻断剂，通过PCR反应中的阻断剂和探针能区分甲基化和非甲基化的序列。本专利技术提供的甲基化的Septin9基因的检测方法及试剂盒能检测Septin9基因V2区域发生甲基化的CpG岛中的bisDNA序列，以及内对照ACTB基因的部分区域中全部bisDNA。针对Septin9基因序列中不含CpG双碱基的区域设计PCR引物；以及针对Septin9基因序列中在不发生甲基化而被亚硫酸盐转化的区域设计阻断剂，这样就让被转化的甲基化序列得到优先扩增。针对发生了甲基化的Septin9基因序列设计的特异性荧光素探针可以在PCR反应中专一地检测出甲基化的序列。优选地，在上述方法中，所述检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白包括以下步骤：采用胶体金免疫层析法检测大便样本中血红蛋白。更优选地，在上述方法中，采用胶体金免疫层析法检测大便样本中血红蛋白包括以下步骤：1、采集粪便周围水样置于样品采集卡上；2、将胶体金免疫层析法检测试纸插入采集卡，滴加工作缓冲液，重新水化样品，根据试纸显色结果判断大便样本中是否含有血红蛋白。本专利技术还提供了一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因的试剂和工具，和用于检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白的试剂和工具。
【技术特征摘要】
1.一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂
盒，该试剂盒包括用于检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基
因的试剂和工具，和用于检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白
的试剂和工具。
2.根据权利要求1所述的联合检测试剂盒，其特征在于，所述检测来
自受试者的血液样本中的甲基化的Septin9基因的试剂和工具包括：抽提
血浆中DNA的试剂和工具、三磷酸脱氧核糖核苷、PCR引物、甲基化的
Septin9基因序列的特异性荧光素探针探针、阻断剂、水生栖热菌脱氧核糖
核酸聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、阴性对照和阳性对照。
3.根据权利要求1或2所述的联合检测...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建铭，韩晓亮，宋乐乐，
申请(专利权)人：博诚研究中心，博尔诚北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。