密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用制造技术

本申请公开了一种密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用。本申请的密执安棒状杆菌多重检测试剂中含有五条锁式探针，分别为Seq ID No.1所示序列的CMN锁式探针、Seq ID No.2所示序列的CMM锁式探针、Seq ID No.3所示序列的CMI锁式探针、Seq ID No.4所示序列的CMS锁式探针、Seq ID No.5所示序列的CMT锁式探针。本申请的多重检测试剂，含有五个亚种的特异性锁式探针，能够同时对五个亚种进行特异性检测；提高了检测效率和检测质量。本申请的试剂及试剂盒，为密执安棒状杆菌高通量检测提供了一种简单有效的途径，适于检验检疫部门使用，为保障生物安全，避免病菌传播提供了有力的科学依据。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及植物病原菌检测领域，特别是涉及一种密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用。
技术介绍
密执安棒状杆菌(Clavibacter michiganensis)为放线菌目、微球菌科、密执安棒状杆菌属，是重要的植物病原细菌。其中，密执安棒状杆菌的五个亚种：Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis(缩写CMN)、Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis(缩写CMM)、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus(缩写CMI)、Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus(缩写CMS)、Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius(缩写CMT)，是目前密执安棒状杆菌属检验检疫研究的重点。这五个亚种是危害性大、分布广的密执安棒状杆菌属亚种，并且，五个亚种的形态学特征近似，分子生物学特征也相近，因此很难鉴别。Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis又称玉米内州萎蔫病菌，主要分布于北美洲，自然寄主包括玉米(Zea mays)、墨西哥假蜀黍(Zea mexicana)，接种寄主包括墨西哥假蜀黍(Euchlaena mexicana)、甘蔗(Saccharum officinarum)、高粱(Sorghum bicolor)、苏丹草(Sorghum sudanense)、鸭茅状磨擦禾(Tripsacumdactyloides)。病菌在种子中至少存活1年，可进行远距离传播，对感染的玉米品种具有毁灭性的危害，是我国进境植物检疫性有害生物。Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis又称番茄细菌性溃疡病菌，在亚洲、欧洲、北美洲、中美洲及加勒比海地区、南美洲、非洲和大洋洲等都有分布，是世界范围的重要病害，也是我国进境植物检疫性有害生物。Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis的自然寄主包括：番茄(Solanumlycopersicum)、辣椒(Capsicum annuum)、茄属(Solanum)、龙葵(Solanum nigrum)、裂叶茄(Solanum triflorum)和其他的茄科杂草。接种寄主包括：燕麦(Avenasativa)、西瓜(Citrullus lanatus)、西瓜(Citrullus vulgaris)、黄瓜(Cucumis sativus)、树番茄(Cyphomandra betacea)、向日葵(Helianthus annuus)、大麦(ordeumvulgare)、秘鲁番茄(Lycopersicon peruvianum)、醋栗番茄(Lycopersiconpimpinellifolium)、心叶烟(Nicotiana glutinosa)、黑麦(Secale cereale)、Solanumhumboldtii、Solanum muricatum、Solanum nigrum var guineense、Solanum
pruniforme、Solanum racemiflorum、马铃薯(Solanum tuberosum)、普通小麦(Triticum aestivum)。病菌在在土壤里的病残组织中可存活2～3年。Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus又称苜蓿细菌性萎蔫病菌，在亚洲、欧洲、北美洲、南美洲、非洲和大洋洲等都有分布，也是世界范围的重要病害，也是我国进境植物检疫性有害生物。其自然寄主包括：百脉根Lotuscorniculatus、苜蓿属Medicago(野苜蓿Medicago falcata、紫苜蓿Medicagosativa)、白香草木樨Melilotus albus、驴喜豆Onobrychis viciaefolia、木犀Syringafragrans、车轴草属Trifolium。接种寄主包括：Medicago dzawknetica、Medicagoglutinosa、Medicago hemicycla、小苜蓿Medicago minima、Medicago prostrata、Medicago sativa var.gaetula、Medicago sativa var.parviflora、Medicago sativa var.pilifera、Medicago sogdiana、Medicago suffruticosa、Medicago tianschanica、Medicago transoxana、玉米Zea mays。Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus一般在受害寄主根管和病残寄主组织上越冬，也可在种子和干草上越冬，春季通过伤口侵入根系，引起萎蔫病。Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus又称马铃薯环腐病菌在亚洲、欧洲、北美洲、中美洲及加勒比海地区、南美洲、非洲等都有分布，是世界范围的重要病害，也是我国进境植物检疫性有害生物。其自然寄主为马铃薯Solanumtuberosum，接种寄主包括：Athenaea、甜菜Beta vulgaris、番茄Lycopersiconesculentum等茄属植物。带菌种薯是主要的初侵染源，采用切块播种时，切刀传病是扩大再侵染的主要途径。切一刀病薯的切刀能传染24～40个健薯。灌溉水或雨水也可将病薯腐烂释放出来的细菌传到健薯或健株根茎上。带菌种薯细菌随养分和水分流动沿维管束依次向上进入新芽、茎、叶柄和叶内，形成系统侵染。当葡匐茎长出时，病菌又沿葡匐茎的维管束进入新生薯块，但种子不带菌。Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius又称密执安棒状杆菌棋盘亚种，是Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus、Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus的近似种，在检验检疫过程中，极易引起混淆。由于以上五种密执安棒状杆菌的形态学特征和分子学特征都极其相似，容易引起混淆，因此，亟需一种能够对密执安棒状杆菌进行有效检测鉴定的方法或试剂。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种密执安棒状杆菌多重检测试剂、试剂盒及其应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种密执安棒状杆菌多重检测试剂，该多重检测试剂中含有五条锁式探针，五条锁式探针分别为Seq ID No.1所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针、Seq ID No.2所示序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种密执安棒状杆菌多重检测试剂，其特征在于：所述多重检测试剂中含有五条锁式探针，五条锁式探针分别为Seq ID No.1所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针、Seq ID No.2所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针、Seq ID No.3所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针、Seq ID No.4所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针、Seq ID No.5所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针。

【技术特征摘要】
1.一种密执安棒状杆菌多重检测试剂，其特征在于：所述多重检测试剂中含有五条锁式探针，五条锁式探针分别为Seq ID No.1所示序列的Clavibactermichiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针、Seq ID No.2所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针、Seq ID No.3所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针、Seq IDNo.4所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针、Seq ID No.5所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针。2.根据权利要求1所述的密执安棒状杆菌多重检测试剂在密执安棒状杆菌滚环扩增检测、滚环扩增液相芯片检测中的应用。3.一种密执安棒状杆菌的滚环扩增检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的多重检测试剂，对待测样品进行滚环扩增，通过五条锁式探针的扩增情况判断待测样品中是否含有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus、Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus和/或Clavibactermichiganensis subsp.tessellarius。4.一种密执安棒状杆菌的滚环扩增液相芯片检测方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)提取待测样品的DNA样本；(2)采用权利要求1所述的多重检测试剂，对提取的DNA样本进行滚环扩增；(3)将五种偶联微球对滚环扩增产物进行杂交和液相芯片分析，获得检测结果；所述五种偶联微球分别为偶联有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特异性锁式探针Zip序列的液相芯片微球、偶联有Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特异性锁式探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯建军，王忠文，吴绍精，龙海，陈枝楠，
申请(专利权)人：深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，深圳市检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44