一种弯曲菌六重PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测弯曲菌的六重PCR检测试剂盒，属于细菌PCR检测技术领域。本发明专利技术的试剂盒含有6对引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-12所示，本发明专利技术的试剂盒能够同时鉴定待检测菌株是否为弯曲菌，并进一步鉴定弯曲菌五种常见菌种，包括空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌。本发明专利技术试剂盒对上述五种弯曲菌检测的灵敏度、特异度均为100％，且操作简单，大大降低了检测成本以及操作难度，具有较好的临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细菌检测
，具体地说涉及检测空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌的六重PCR检测试剂盒。
技术介绍
弯曲菌是主要的食源性病原菌，其感染导致的疾病称为弯曲菌病，属于人类新发传染病之一。目前，欧美国家弯曲菌的感染被列为食源性病原菌感染的首位，其感染率显著超过其他食源性病原菌。除肠炎外，空肠弯曲菌的感染可以导致格林-巴利综合征(GBS)。GBS是一种自身免疫导致急性神经肌肉瘫痪，残疾率7～15％，死亡率3％～10％，目前没有特效药物，疾病负担严重。美国将可导致GBS空肠弯曲菌列为生物恐怖病原之一。目前研究发现导致人类弯曲菌病的弯曲属的主要菌种是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。此外，胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌同样可以导致人类的感染病引起疾病。弯曲菌属内不同菌种鉴定技术的建立对于弯曲菌的研究具有重要意义。目前无论腹泻患者以及动物的粪便标本以及不同的食物标本中，不仅可以检测到空肠弯曲菌和结肠弯曲菌，还同时可以检出弯曲菌属的其它菌种，最常见的是胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌。研究发现弯曲菌属内不同菌种的耐药特征及致病特点各有不同，属内菌种的鉴定对于弯曲菌感染的防控和治疗具有重要的意义。目前关于弯曲菌属内不同菌种的鉴定大多依赖于生化反应的特点以及针对不同菌种的PCR技术，鉴定过程复杂繁琐。为保障人民食品健康安全，针对不同食源性弯曲菌感染采取积极有效的防控措施，迫切需要一种能够快速、准确、广谱鉴定弯曲菌属内菌种的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种弯曲菌六重PCR检测试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种检测五种弯曲菌的方法，所述五种弯曲菌分别为：空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌。本专利技术的技术方案主要包括以下两个方面：(1)通过16sRNA基因的DNA序列的比对，获得弯曲菌属内特异核酸片段；(2)利用BLASTn与vectorNITsuite6.0软件对所有特异基因的DNA序列进行比对，NCBI数据库筛查，确定DNA序列特异性，确定6条特异序列片段；(3)通过引物设计软件以及多种PCR优化技术优化PCR条件，建立六重PCR技术，一次PCR完成包括弯曲菌属及属内五种菌种的鉴定。具体地，本专利技术提供了检测弯曲菌的引物组合，含有6对引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-12所示。本专利技术提供了上述引物组合在制备弯曲菌检测试剂盒或检测试剂中的应用。本专利技术提供了核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示的引物对在检测弯曲菌中的应用或在制备检测弯曲菌试剂盒中的应用。本专利技术提供了核苷酸序列如SEQIDNO.3-4所示的引物对在检测空肠弯曲菌中的应用或在制备检测空肠弯曲菌试剂盒中的应用。本专利技术提供了核苷酸序列如SEQIDNO.5-6所示的引物对在检测结肠弯曲菌中的应用或在制备检测结肠弯曲菌试剂盒中的应用。本专利技术提供了核苷酸序列如SEQIDNO.7-8所示的引物对在检测胎儿弯曲菌中的应用或在制备检测胎儿弯曲菌试剂盒中的应用。本专利技术提供了核苷酸序列如SEQIDNO.9-10所示的引物对在检测海鸥弯曲菌中的应用或在制备检测海鸥弯曲菌试剂盒中的应用。本专利技术提供了核苷酸序列如SEQIDNO.11-12所示的引物对在检测乌普萨拉弯曲菌中的应用或在制备检测乌普萨拉弯曲菌试剂盒中的应用。本专利技术提供一种弯曲菌检测试剂盒，含有SEQIDNO.1-2、SEQIDNO.3-4、SEQIDNO.5-6、SEQIDNO.7-8、SEQIDNO.9-10和/或SEQIDNO.11-12所示的引物对。进一步地，本专利技术提供一种弯曲菌检测试剂盒，含有SEQIDNO.1-12所示引物。更进一步地，本专利技术提供的弯曲菌检测试剂盒能够鉴定空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌。本专利技术的试剂盒，使用本专利技术提供的上述引物组合对待测细菌DNA进行PCR检测，当PCR扩增片段出现816bp+300bp的两条带时，菌株鉴定为空肠弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+500bp的两条带时，菌株鉴定为结肠弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+435bp的两条带时，菌株鉴定为胎儿弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+250bp的两条带时，菌株鉴定为海鸥弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+200bp的两条带时，菌株鉴定为乌普萨拉弯曲菌。所述PCR的反应程序为：94℃5min；94℃1min，64℃1min，72℃1min，共2个循环；94℃1min，62℃1min，72℃1min，共2个循环；94℃1min，60℃1min，72℃1min，共2个循环；94℃1min，58℃1min，72℃1min，共2个循环；94℃1min，56℃1min，72℃1min，共2个循环；94℃1min，54℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min。本专利技术还提供了用于检测弯曲菌的靶基因组合，含有6条特异性靶基因，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.13-18所示，其编码的氨基酸序列分别如SEQIDNO.19-24所示。本专利技术提供了上述靶基因组合在制备检测弯曲菌试剂盒中的应用。本专利技术提供了弯曲菌靶基因在制备检测弯曲菌试剂盒中的应用，所述靶基因为SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17和/或SEQIDNO.18。本专利技术进一步提供了检测食品、粪便中弯曲菌的方法，使用核苷酸序列如SEQIDNO.1-12所示的引物，对待测食品、粪便中分离的菌株进行PCR检测，当PCR扩增片段出现816bp+300bp的两条带时，菌株鉴定为空肠弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+500bp的两条带时，菌株鉴定为结肠弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+435bp的两条带时，菌株鉴定为胎儿弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+250bp的两条带时，菌株鉴定为海鸥弯曲菌；当PCR扩增片段出现816bp+200bp的两条带时，菌株鉴定为乌普萨拉弯曲菌。本专利技术以弯曲菌的特异DNA序列以及五种弯曲菌菌种(包括空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌)特异的DNA序列及引物序列，建立了本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测弯曲菌的引物组合，其特征在于，含有6对引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑12所示。

【技术特征摘要】
1.检测弯曲菌的引物组合，其特征在于，含有6对引物，其核苷
酸序列如SEQIDNO.1-12所示。
2.权利要求1所述的引物组合在制备弯曲菌检测试剂盒或检测试
剂中的应用。
3.一种弯曲菌检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的
引物组合。
4.如权利要求3所述的弯曲菌检测试剂盒，其特征在于，其能够
鉴定空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、海鸥弯曲菌和乌普萨拉弯
曲菌。
5.如权利要求3所述的弯曲菌检测试剂盒，其特征在于，使用权
利要求1所述的引物组合，对待测细菌DNA进行PCR检测，
当PCR扩增片段出现816bp+300bp的两条带时，菌株鉴定为空肠
弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+500bp的两条带时，菌株鉴定为结肠
弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+435bp的两条带时，菌株鉴定为胎儿
弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+250bp的两条带时，菌株鉴定为海鸥
弯曲菌；
当PCR扩增片段出现816bp+200bp的两条带时，菌株鉴定为乌普
萨拉弯曲菌。
6.如权利要求3-5任一所述的弯曲菌检测试剂盒，其特征在于，
所述PCR的反应程序为：
94℃5min；
94℃1min，64℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，62℃1min，72℃1min，共2个循环；
94℃1min，60℃1min，7...

【专利技术属性】
技术研发人员：张茂俊，王敏，张建中，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11