艰难梭菌素及其使用方法技术

本公开涉及编码R型高分子量细菌素的整个基因簇的发现和分离，所述细菌素特异性地杀灭危险的病原体艰难梭菌细菌。还公开了在无害需氧的生产细胞中产生R型细菌素的方法。还公开了小的、非ORF1374受体结合域(RBD)，将所述RBD并入艰难梭菌素中以形成具有改变的杀菌谱的工程化的或变体艰难梭菌素。本文所提供的变体艰难梭菌素可包括异源RBD及其同源基板附着区(BPAR)或融合的BPAR。本发明专利技术提供具有提高的热和pH稳定性的有效的杀菌剂，以及用于生产其的方法，以便在可能造成巨大伤害且甚至是受感染患者或农畜的死亡的胃肠道环境中选择性地杀灭艰难梭菌细菌。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】授权信息本专利技术根据国家卫生研究院的国家变态反应和感染疾病学院(NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases)授予的拨款号R43AI098186-01在政府支持下完成。美国政府对本专利技术享有某些权利。序列表本申请含有以ASCII格式以电子方式提交的序列表并且在此以引用的方式整体并入。在2014年3月6日创建的所述ASCII副本的名称是CF210341_SL.txt并且大小是476,921个字节。专利
本申请总体上涉及足以产生细菌素(且更具体地，特异性地杀灭艰难梭菌(Clostridiumdifficile)的R型高分子量细菌素)的基因簇的鉴别和分离，以及改变其杀菌特异性、产生和使用其的方法。专利技术背景艰难梭菌是专性厌氧、产芽胞的革兰氏阳性细菌，其对于人及其它哺乳动物是众所周知的病原体(Bartlett等人,1977；Bartlett等人,1979；Keel等人,2007；Sunenshine&McDonald,2006)。在低密度下，艰难梭菌可无害地驻留在哺乳动物胃肠(GI)道中，但一旦扩张(经常是由于施用减少共生细菌的抗生素)，艰难梭菌细菌便产生足以引起从轻度腹泻疾病到特征性伪膜性结肠炎的一系列疾病的外毒素，其是危及生命的，特别是对于老年人及其他具有显著并发症的人(Bartlett,2002)。因为由这种病原体形成的芽孢广泛地传播且在医院和长期护理机构中难以根除或灭活，所以患者由艰难梭菌定殖的可能性在他们进入此类机构之后急剧地提高(Bartlett,2007)。实际上，最近已充分记载了相对较新的艰难梭菌菌株，其是艰难梭菌的超毒性产毒菌株BI/NAP1/027，它在大规模的爆发环境里引起严重疾病(Spigaglia等人,2002；Pépin等人,2004；McDonald等人,2005；Muto等人,2005；Loo等人,2005；Belmares等人,2009)。艰难梭菌相关疾病(CDAD)在先前处于低风险下的儿童中的发病率也大幅度地提高(Benson等人,2007；Zilberberg等人,2010)。通过施用抗生素在无症状的载体或定殖的受试者中预防地清除病原体由于诱发艰难梭菌相关疾病的高风险而是高度禁忌的。由革兰氏阴性细菌制造的R型细菌素已经有所描述并且已由杀灭其它竞争性革兰氏阴性菌株(甚至在一些情况下革兰氏阴性细菌的其它种或属)的此类细菌来配置(Kageyama等人,1964；Kageyama等人,1964a；Kingsbury,D,1966；Blackwell和Law,1981；Blackwell等人,1982；Campagnari等人,1994；Strauch等人,2001；Jabrane等人,2002)。已经描述了R型脓菌素的基板附着区(BPAR)与异源受体结合域(RBD)的融合，从而使得产生对革兰氏阴性细菌具有新型杀菌特异性的新型R型脓菌素(Williams等人,2008；Scholl等人,2009)。其它高分子量细菌素或R型细菌素已在革兰氏阳性细菌中有所描述(Coetzee等人,1968；Thompson和Pattee,1981；Zink等人,1995)。然而，关于由革兰氏阳性细菌产生的R型高分子量细菌素结构知之甚少。虽然已对此进行了描述，但未在遗传水平上进行表征或以开发有用的试剂所支持或必需的方式进行操纵。已经针对2种梭菌物种(肉毒杆菌(botulinum)和产气荚膜杆菌(perfringens))描述了高分子量细菌素(Ellison和Kautter,1970；Anastasio等人,1971；Nieves等人,1981)。未对由艰难梭菌产生的或杀灭艰难梭菌的细菌素进行描述。专利技术概述本专利技术是基于编码针对其它艰难梭菌菌株有杀菌性的艰难梭菌特异性R型细菌素(在本文中称为“艰难梭菌素(diffocin)”)的整个遗传基因座或基因簇的分离；艰难梭菌素基因簇的表达和艰难梭菌素在需氧细菌中的产生；以及艰难梭菌素基因簇的开放阅读框(ORF)1374确定艰难梭菌素针对艰难梭菌菌株的杀菌谱的发现。本专利技术提供一种通过遗传工程来改变艰难梭菌素的特异性以产生新型艰难梭菌素以及制造和直接或间接地施用艰难梭菌素以将艰难梭菌从定殖的动物(包括人)的胃肠(GI)道中清除的实用方法。艰难梭菌素的施用可以治疗或预防艰难梭菌感染及相关疾病的发展，而不会像传统的抗生素一样损害身体健康所必需的共生的GI细菌。根据本专利技术，提供编码R型高分子量(hmw)细菌素的分离的核酸分子。在一个实施方案中，提供编码R型高分子量(hmw)细菌素的分离的核酸分子，其中核酸分子来自艰难梭菌菌株的基因组，且其中R型hmw细菌素包含与选自由SEQIDNO:4-16、18、19、以及66-80组成的组的多肽至少80％同一的多肽，且R型hmw细菌素具有结合至少一个其它艰难梭菌菌株受体的受体结合域(RBD)且因此具有针对另一个或多个艰难梭菌菌株的杀菌活性。在具体的实施方案中，核酸分子来自选自由以下组成的组的艰难梭菌菌株的基因组：Cd4、Cd16、Cd19108、Cd19123、Cd19126、Cd19145、以及ATCC保藏号43593。在一些实施方案中，菌株是Cd16且核酸分子包括SEQIDNO:1或菌株是Cd4且核酸分子包括SEQIDNO:61。在另一实施方案中，提供编码R型高分子量(hmw)细菌素的分离的核酸分子，其中核酸分子来自第一艰难梭菌菌株的基因组且包含与编码SEQIDNO:66-77的多核苷酸至少80％同一的第一多核苷酸序列，其中核酸分子还包含编码来自第二艰难梭菌菌株的基因组的原噬菌体或原噬菌体残留物的受体结合域(RBD)或感染艰难梭菌的噬菌体的RBD的异源序列，且其中R型hmw细菌素包含与SEQIDNO:78的多肽至少80％同一的第一基板附着区(BPAR)多肽的氨基末端部分的至少50个连续氨基酸，且其中R型hmw细菌素具有针对至少一个艰难梭菌菌株的杀菌活性。在本专利技术的另一实施方案中，提供由本专利技术的核酸分子编码的分离的R型细菌素。一方面，R型细菌素在需氧生产细菌中表达。在一些实施方案中，R型细菌素可向动物经口施用并且以仍展现杀菌活性的形式排泄到粪便中。在具体的实施方案中，R型细菌素在25℃下在约2.5与10.6之间的pH下孵育30分钟之后保留一些杀菌活性。一方面，R型细菌素在2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码R型高分子量(hmw)细菌素的分离的核酸分子，其中所述核酸分子来自第一艰难梭菌菌株的基因组并且包含：与编码SEQ ID NO:66‑77的第二多核苷酸至少80％同一的第一多核苷酸序列，其中所述核酸分子还包含编码来自第二艰难梭菌菌株的基因组的原噬菌体或原噬菌体残留物的受体结合域(RBD)或感染艰难梭菌的噬菌体的RBD的异源序列，并且其中所述R型hmw细菌素包含与SEQ ID NO:78的多肽至少80％同一的第一基板附着区(BPAR)多肽的氨基末端部分的至少50个连续氨基酸，并且其中所述R型hmw细菌素具有针对至少一个艰难梭菌菌株的杀菌活性；以及编码与所述RBD同源的第二BPAR的至少所述C末端部分的第三多核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.14 US 13/829,7251.一种编码R型高分子量(hmw)细菌素的分离的核酸分子，其中
所述核酸分子来自第一艰难梭菌菌株的基因组并且包含：
与编码SEQIDNO:66-77的第二多核苷酸至少80％同一的第一
多核苷酸序列，其中所述核酸分子还包含编码来自第二艰难梭菌菌株
的基因组的原噬菌体或原噬菌体残留物的受体结合域(RBD)或感染
艰难梭菌的噬菌体的RBD的异源序列，并且
其中所述R型hmw细菌素包含与SEQIDNO:78的多肽至少
80％同一的第一基板附着区(BPAR)多肽的氨基末端部分的至少50个
连续氨基酸，并且
其中所述R型hmw细菌素具有针对至少一个艰难梭菌菌株的杀
菌活性；以及
编码与所述RBD同源的第二BPAR的至少所述C末端部分的第
三多核苷酸。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述RBD与选自由以下
组成的组的RBD至少80％同一：SEQIDNO:92、94、96、98、100、
102、104、106、108、110、112以及116。
3.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述第三多核苷酸编码
所述RBD的全长同源BPAR。
4.如权利要求1所述的核酸分子，其中编码所述RBD的所述同
源BPAR的所述第三多核苷酸插入所述核酸分子中以便使所述RBD
的同源BPAR的C末端部分融合至所述第一BPAR的氨基末端部分。
5.如权利要求1所述的核酸分子，其中编码所述RBD的同源

\tBPAR的C末端部分的所述第三多核苷酸包含编码与选自由以下组成
的组的序列至少80％同一的BPAR的序列：SEQIDNO:88、91、93、
95、97、99、101、103、105、107、109、111以及115。
6.如权利要求1所述的核酸分子，还包含编码所述RBD的同源
分子伴侣的第四多核苷酸。
7.如权利要求6所述的核酸分子，其中所述同源分子伴侣选自
由以下组成的组：SEQIDNO:89、90、113、114以及117。
8.一种表达盒，其包含如权利要求1所述的核酸分子。
9.如权利要求8所述的表达盒，其中所述R型高分子量(hmw)
细菌素的表达是诱导型的或阻抑型的。
10.如权利要求9所述的表达盒，其中所述表达由小分子诱导物
或去阻抑物来诱导。
11.如权利要求10所述的表达盒，其中所述小分子诱导物或去
阻抑物是活性氧物质(ROS)或ROS的生成物。
12.如权利要求11所述的表达盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·R·戈沃尼，D·M·格布哈特，D·M·肖尔，
申请(专利权)人：阿维德百奥提克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US