本发明专利技术提供用于调节肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素的活性的方法。在一个实施例中，本发明专利技术提供具活性的破伤风神经毒素轻链(LC/T)和肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的衍生物，或具活性的整个破伤风神经毒素和肉毒杆菌神经毒素的衍生物。在另一个实施例中，本发明专利技术提供用于改善当前使用肉毒杆菌神经毒素的疗法的方法。在另一个实施例中，本发明专利技术提供应用肉毒杆菌神经毒素或肉毒杆菌神经毒素的轻链于各种治疗或美容用途的新颖方法。在一个实施例中，本发明专利技术提供的方法用于减少肉毒杆菌神经毒素于各种用途出现的免疫耐药性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求以2013年8月21日提交的美国临时专利申请号61/868,560为优先权基础，所述优先权文件的所有内容及公开都以引用方式被纳入本申请中。本申请引用了多篇参考文献及出版物。所述参考文献及出版物的所有内容都以引用方式被纳入本申请中以便更能全面地描述与本专利技术相关的现有技术。
本专利技术涉及包括肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素的梭菌属神经毒素的改造，以及这些神经毒素及其衍生物的用途。
技术介绍
梭菌属神经毒素(ClostridiaNeurotoxins,CNTs)是其中一种最毒害人类的蛋白毒素。例如，肉毒杆菌神经毒素(BotulinumNeurotoxin,BoNT)会引起弛缓性麻痹并导致肉毒中毒，破伤风神经毒素(TetanusNeurotoxin,TeNT)则会引发痉挛性麻痹。梭菌属神经毒素的分子量约150kDa,是一个具有典型A-B链-结构/功能特性的双链蛋白,其中B区域(结合区域)与哺乳动物细胞的表面分子先结合，A区域(活性区域)随后转位至细胞内的位置(1).梭菌属神经毒素由三个功能区域组成：N-末端的催化区域(轻链，LC)、中间的转运区域(重链，HCT)及C-末端的受体结合区域(重链，HCR)(2)。梭菌属神经毒素属于锌金属蛋白酶,能够切割SNARE蛋白(SolubleN-ethylmaleimide-SensitiveFactorAttachmentREceptor,可溶性NSF附着受体)，SNARE蛋白干扰突触小泡与质膜融合，最终阻止神经细胞分泌神经传导物质(1,3)。哺乳动物神经元的胞吐作用是由一种SNARE蛋白质复合物所带动，该蛋白质复合物由囊泡SNARE蛋白囊泡相关膜蛋白-2(vesicleassociatedmembraneprotein-2,VAMP2)以及两种质膜SNARE蛋白，SNAP25(分子量为25kDa的突触体相关蛋白Synaptosome-AssociatedProtein)和突触融合蛋白1a(syntaxin1a)所形成(4)。BoNT共有七个血清型(血清型A-G)能切割三种SNARE蛋白其中一种的某些特定氨基酸残基：BoNT血清型B、D、F和G及TeNT能切割VAMP2，BoNT血清型A及E能切割SNAP25，和BoNT血清型C能切割SNAP25和突触融合蛋白1a(3,5-7)。BoNTs最被广泛使用于蛋白治疗。早在1989年，BoNT血清型A(BoNT/A)经美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗斜视、眼睑痉挛、面肌痉挛，也可用于颈部肌张力障碍、化妆品、眉间面部线条及腋窝多汗症。由于BoNT血清型A对治疗肌张力障碍和其他与不随意肌活动有关的毛病有效，并且符合安全性，BoNT血清型A在眼科、胃肠道科、泌尿外科、骨科、皮肤科、分泌及痛症各个领域已被批准作为实验性使用或药品标示外使用(8-17)。FDA于2000年12月11日批准肉毒杆菌神经毒素血清型B(MYOBLOCTM)用于治疗患有颈部肌张力障碍的患者，以减少与此病相关的头部位置异常和颈部疼痛的严重性(18,19)。BoNT对治疗不随意肌的痉挛及收缩、美容或其它应用只有暂时性的效果，因此需要重复注射BoNT。在一些患者中，BoNT可诱发针对BoNT毒素的中和抗体的产生，并降低BoNT的可用性。由此引起的免疫耐药性限制了BoNT的成效，或会使病人对进一步治疗毫无反应(9,10,20-26)。虽然患者对BoNT治疗产生免疫耐药性的确切百分比不详，但相比BoNT血清型B的治疗，通常较少患者对BoNT血清型A的治疗产生免疫耐药性(9,26)。这可能是由于BoNT血清型A复合物所使用的剂量比BoNT血清型B复合物的较低(27)。BoNT中和抗体多见于接受颈部肌张力障碍或痉挛治疗的患者，这是由于治疗此病症需要更大剂量的毒素和定期给药。至于治疗喉张力障碍、眼睑痉挛的患者或化妆品用途，由于需要较小的BoNT剂量，中和抗体不太常见(9,28,29)。降低治疗剂量或有助减少产生BoNT治疗的免疫耐药性。迄今为止仍未有方案能有效处理BoNT免疫耐药性的问题。过往曾有研究试图阻堵涉及诱导中和抗体的BoNT表位。研究人员将取自耐药患者的中和抗体与BoNT血清型A和BoNT血清型B的不同区域的反应,从而确定一系列可能涉及诱导中和抗体的免疫原区(39-41)。有报告指肽与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)缀合能抑制针对肽的免疫反应。BoNT血清型A的重链区域(HC/A)有较强的免疫反应,研究人员将BoNT/A重链与mPEG缀合，并在小鼠接受BoNT/A治疗前施用该缀合物以进行预先免疫。结果显示，某些mPEG缀合物减少了中和抗体的产生(42)，表示该预先免疫程序或可临床应用于免疫耐药的患者。由于BoNT的治疗特性和免疫耐药性相互关联，改造BoNT成为更高活性的毒素以降低其治疗所需剂量是克服免疫耐药性最好的方法。Rummel等人将BoNT血清型B重链区域中用来结合神经节苷脂的模序修改，相比原型毒素，改造后的毒素的结合和毒性提升高达三倍(43)。然而，BoNT的受体结合区域经改造后有可能影响结合作用的选择性。此外，改造结合区域不一定可以显着增加毒素的效力以避免产生免疫耐受性。相反，改造轻链(LC)以改变BoNT活性或更有助于避免产生免疫耐受性。因此，有必要改造梭菌属神经毒素，如肉毒杆菌神经毒素，以提高其治疗效果。专利技术概述本专利技术提供了调节肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素的活性的方法。在一个实施例中，本专利技术的方法通过提升毒素的催化活性以增强破伤风神经毒素轻链(LC/T)和肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的底物识别。在一个实施例中，本专利技术提供肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素的衍生物及其应用。在一个实施例中，本专利技术提供破伤风神经毒素轻链(LC/T)的衍生物或整个破伤风神经毒素的衍生物,这些衍生物的活性被更改。在一个实施例中，本专利技术提供破肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/T)的衍生物或整个肉毒杆菌神经毒素的衍生物,这些衍生物的活性被更改。在一个实施例中，本专利技术所述的肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的衍生物或肉毒杆菌神经毒素衍生物可以在各种治疗、化妆品或其它应用中使用。在另一个实施例中，本专利技术所述的肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的衍生物或肉毒杆菌神经毒素衍生物用于治疗减少肉毒杆菌神经毒素的免疫耐药性。在另一个实施例中，本专利技术提供了使用肉毒杆菌神经毒素以改善当前的疗法的方法。在另一个实施例中，本专利技术提供了將肉毒杆菌神经毒素的衍生物或肉毒杆本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种经改造的肉毒杆菌神经毒素轻链蛋白，其特征在于，所述肉毒杆菌神经毒素的氨基酸序列为SEQ ID NO.:1，所述轻链蛋白包含一个或多个如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸的变异。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.21 US 61/868,5601.一种经改造的肉毒杆菌神经毒素轻链蛋白，其特征在于，所述肉毒杆菌神经毒素的氨
基酸序列为SEQIDNO.:1，所述轻链蛋白包含一个或多个如SEQIDNO.:1所示的氨
基酸的变异。
2.权利要求1所述的轻链蛋白，其特征在于，所述氨基酸的变异选自:Ser201,Ala263和
Ile264。
3.权利要求1所述的轻链蛋白，其特征在于，包含SEQIDNO.:2的氨基酸序列。
4.一种包含权利要求1所述的轻链蛋白的组合物，其特征在于，所述轻链蛋白与一个或
多个的第二种蛋白融合或偶合,所述第二种蛋白为源自肉毒杆菌神经毒素或其他生物
的蛋白。
5.权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述第二种蛋白是天然蛋白或人工蛋白。
6.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的轻链蛋白和一个药学可接受的载体。
7.一种用于改善或治疗受试者的疾病或状况的方法，其特征在于，所述方法包含给予受
试者有效份量的如权利要求1所述的轻链蛋白。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述疾病或状况选自:斜视，眼睑痉挛，半面
痉挛，颈部肌张力障碍，痉挛，眉间面部线条，腋窝多汗症，不随意肌痉挛，下泌尿
道毛病，胃肠道毛病，痉挛性发声困难，颞下颌关节症，慢性糖尿病性神经...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈声，
申请(专利权)人：香港理工大学，
类型：发明
国别省市：中国香港;81
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