一种检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR试剂盒及其应用。本发明专利技术首先提供了用于检测鲑鱼甲病毒的实时荧光定量PCR引物对，其序列分别为SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术还提供了含有上述引物对的Eva Green荧光定量PCR试剂盒及其检测鲑鱼甲病毒的方法。研究表明，使用本发明专利技术的引物或试剂盒检测鲑鱼甲病毒，具有简便、快速、准确、灵敏度高、特异性好等优点，可用于鲑鱼甲病毒六个基因型的检测，本发明专利技术的提出为鲑鱼甲病毒的检测提供了一种有效的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种检测鲑鱼甲病毒的EvaGreen荧光定量PCR检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及用于病毒检测的引物和试剂盒，特别是涉及用于检测鲑鱼甲病毒的特异性的荧光定量PCR引物，本专利技术还涉及利用该引物和EvaGreen荧光染料进行鲑鱼甲病毒检测的方法和试剂盒。本专利技术属于病毒检测

技术介绍
鲑鱼甲病毒(salmonidalphavirus，SAV)隶属于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒属(Alphavirus)，主要感染大西洋鲑(salmosalar)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和褐鳟(SalmotruttaL.)等鲑科鱼类引起胰脏病、心肌炎症和昏睡等症状，致死率达1％～48％，并在水产养殖的各个阶段均有爆发。1995年Nelson等在爱尔兰首次从患胰脏病的大西洋鲑和虹鳟体内分离出该病毒，1997年Castric等又在法国从患昏睡病的大西洋鲑和虹鳟体内分离到SAV，目前该病广泛流行于英格兰、苏格兰、挪威、法国、波兰、意大利和西班牙等欧洲国家，据统计从1995年至2007年发病率逐年增加高达90％，每年由此疫病造成巨大的经济损失。2013年鲑鱼甲病毒感染被列入OIE水生动物疫病名录中。虽然，我国目前尚未有文献报道检测到该病毒，但是，随着近年我国对鲑科鱼类进口和鲑科鱼类卵引进的增加，该病传入我国的风险也日益增大。因此，我国建立SAV快速诊断和测检方法是紧迫的任务。目前已发现六个基因型(SAV1、SAV2、SAV3、SAV4、SAV5、SAV6)。其中，SAV1、SAV3、SAV4、SAV5、SAV6可感染大西洋鲑引起胰腺病(Salmonpancreasdisease，PD)；SAV2可感染虹鳟引起睡病(Sleepingdisease，SD)。SAV病毒粒子具有囊膜，大小为65nm。单股正链RNA病毒，基因组长11-12kb，且含有两个开放阅读框(ORF)。基因组的第二个ORF编码26S子基因的mRNA，最终产生5个结构蛋白，即衣壳蛋白、E3、E2、6K、和E1共同构成了病毒的囊膜糖蛋白。E2在未成熟时，与E3相连，组成E2的前体，E3的作用相当于E2的信号肽。当E2成熟时，E2与E3分离，E2被转运到病毒粒子表面。近年来，我国一些地方，特别是北方地区，大规模发展了冷水鱼类(如：虹鳟)养殖，且取得了巨大的经济效益。虽然我国目前尚未发现该病毒，但是随着近年我国对鲑科鱼类进口的增加，该病传入我国的风险也日益增大，因此有必要尽早建立对鲑鱼甲病毒快速灵敏的检测方法，防止该病传入我国，SAV的有效预报或者诊断是我们必须解决的问题。核酸检测技术因具有快速、灵敏、特异性强等特点，已成为鲑鱼甲病毒的主要检测技术，广泛用于临床样品的检测和分子流行病学调查。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够简便、快速、灵敏、特异和高效地检测鲑鱼甲病毒的EvaGreen荧光定量PCR试剂盒。本专利技术的另一个目的在于提供检测鲑鱼甲病毒的荧光定量PCR方法。该方法检测覆盖鲑鱼甲病毒六个基因型，是一种特异性强，准确性高、灵敏性高的检测方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术对已知鲑鱼甲病毒基因序列进行比对，筛选出鲑鱼甲病毒六个基因型的保守区序列，即E2蛋白基因中的一段保守序列(9471-9668bp)。针对该序列本专利技术专利技术人经反复筛选和验证，得到一对用于检测鲑鱼甲病毒六个不同基因型的荧光定量PCR引物，扩增片段大小为197bp(SEQIDNO.1所示)，所述引物的序列如下：上游引物(TS1)：5’-GCAACATTGCCGATCTGAGGTGTGG-3’(SEQIDNO.2)下游引物(TS2)：5’-CGTAACATGCAACGACAGCCAGTGC-3’(SEQIDNO.3)进一步的，本专利技术还提出了一种用于检测鲑鱼甲病毒的EvaGreen荧光定量PCR试剂盒，含有用于检测鲑鱼甲病毒的荧光定量PCR引物对以及EvaGreen荧光定量PCR扩增缓冲液，其中所述的引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的序列如SEQIDNO.2所示，所述下游引物的序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，所述EvaGreen荧光定量PCR扩增缓冲液包括dNTPs、Mg2+、EvaGreen、DNA聚合酶和RNA酶抑制剂。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，所述EvaGreen荧光定量PCR扩增缓冲液为GoldenHSEVAGreenqPCRMix。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，还包括阳性对照和阴性对照，所述的阳性对照为含有鲑鱼甲病毒E2基因的重组质粒标准品，所述的阴性对照为去离子水。更进一步的，本专利技术还提出了使用本专利技术所述的EvaGreen荧光定量PCR试剂盒检测鲑鱼甲病毒时，包括以下步骤：(1)将待测样本匀浆，离心，取上清进行总RNA提取；(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样品保存至-80℃，备用；(3)以步骤(2)得到的总cDNA、阳性对照品和阴性对照品分别为模板，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增；(4)PCR反应结束后，记录样品的Ct值和起始DNA拷贝数。其中，优选的，PCR扩增反应体系为：5×GoldenHSEVAGreenqPCRMix4μl，50×ROXReferenceDye0.4μl，浓度为0.3μM的上游引物及下游引物各0.5μl，模板1μl，最后用灭菌的去离子水补至20μl。其中，优选的，实时荧光定量PCR的反应程序为：(1)95℃预变性15min；(2)95℃变性10s、60℃退火30s，共40个循环。其中，优选的，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：Ct值≤40.0时样品结果为阳性；Ct值＞40.0的样品结果为阴性。再进一步的，本专利技术还提出了所述的EvaGreen荧光定量PCR试剂盒在制备检测鲑鱼甲病毒的试剂中的应用。其中，所述的鲑鱼甲病毒包括以下六个基因型：SAV1、SAV2、SAV3、SAV4、SAV5以及SAV6。相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术参考多种鲑鱼甲病毒六个基因型毒株，基于E2基因，设计合成可以用于EvaGreen荧光定量PCR检测的特异性引物；2、本专利技术成功建立了EvaGreen荧光定量PCR检测方法，优选采用GoldenHSEVAGreen为荧光试剂，成本低，定量PCR反应液配制简单，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、定性检测，重复性好，可信度高，可适用于各荧光定量PCR扩增仪；3、本专利技术定量检测方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，可用于所有鲑鱼甲病毒六个基因型毒株的快速检测。附图说明图1为鲑鱼甲病毒EvaGreen荧光定量PCR扩增动力学曲线；图2为鲑鱼甲病毒EvaGreen荧光定量PCR标准曲线；图3为鲑鱼甲病毒EvaGreen荧光定量PCR扩增产物溶解曲线；图4为普通PCR方法检测本专利技术建立引物的灵敏性核酸电泳图；图5为普通PCR方法检测OIE批准的用于检测鲑鱼甲病毒引物的灵敏性核酸电泳图；图6为鲑鱼甲病毒EvaGreen荧光定量PCR的特异性试验扩增动力学曲线。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测鲑鱼甲病毒的Eva Green荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，含有用于检测鲑鱼甲病毒的荧光定量PCR引物对以及Eva Green荧光定量PCR扩增缓冲液，其中所述的引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测鲑鱼甲病毒的EvaGreen荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，含有用于检测鲑鱼甲病毒的荧光定量PCR引物对以及EvaGreen荧光定量PCR扩增缓冲液，其中所述的引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的序列如SEQIDNO.2所示，所述下游引物的序列如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的EvaGreen荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述EvaGreen荧光定量PCR扩增缓冲液包括dNTPs、Mg2+、EvaGreen、DNA聚合酶和RNA酶抑制剂。3.根据权利要求2所述的EvaGreen荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述EvaGreen荧光定量PCR扩增缓冲液为GoldenHSEVAGreenqPCRMix。4.根据权利要求1-3任一项所述的EvaGreen荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述的阳性对照为含有鲑鱼甲病毒E2基因的重组质粒标准品，所述的阴性对照为去离子水。5.如权利要求1-4任一项所述的EvaGreen荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，用于检测鲑鱼甲病毒时，包括以下步骤：(1)将待测样本匀浆，离心，取上清进行总RNA提取；(2)以步骤(1)得到的总RNA为模板，反转录合成总cDNA，总cDNA样...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘敏，李一经，施文，唐立杰，徐义刚，宋傲臣，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23