本发明专利技术涉及一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括A液(PCR反应液)：含染料的2×Taq?PCR?MasterMix、上游引物7-5f(20μM)、下游引物7-5r(20μM)、超纯水；B液(阳性对照)为鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌标准株DNA，采用利用该试剂盒在鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原真菌DNA、鹰嘴豆壳二孢叶枯病病残体、带病土壤及带病种子中均能特异地扩增出片段长度为440bp的特异扩增产物的方法进行检测。本发明专利技术所述的试剂盒用于生产实践中被鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌感染的植物组织、土壤及种子的快速、灵敏、特异的检测，同时用于田间病害的早期监测，也可为海关进出口鹰嘴豆所携带的鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌高灵敏快速分子检测和鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域，更具体涉及一种。
技术介绍
鹰嘴豆壳二孢叶枯病由鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei引起,是一种毁灭性的病害。1911年，鹰嘴豆壳二孢叶枯病在巴基斯坦被首次发现，该病害的危害性很高，在鹰嘴豆的重要种植区巴基斯坦，年受害面积高达25-50%。冷凉的气候非常适合病害发展，常造成100%的产量损失。2007年，该病害在新疆北部的鹰嘴豆主栽区昌吉州木垒县、奇台县等地暴发，其中仅在木垒县发病面积为4000hm2，平均为害株率46%，严重田块为害株率达到100%，产量损失率为40% -50%。该病害主要危害叶片、叶柄、茎杆，也可侵染幼嫩的荚果。叶片被害后由叶缘向内扩散，形成“U”形或“V”形浅褐色至深褐色病斑，潮湿时病斑上产生分散的细小黑点，叶柄和茎杆受害初期产生水浸状病斑，随后病斑逐渐变为深褐色，病斑处凹陷并逐渐萎蔫干枯造成落叶断枝，严重时整株枯萎死亡。豆荚受害初期产生水浸状病斑，然后变成深褐色病斑，严重时豆荚干枯。雨水偏多年份，发病严重，产量损失极大。因此，开展鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌检测，防止其从发病区向未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对鹰嘴豆壳二孢叶枯病的传播与控制具有重要意义。自从发现鹰嘴豆壳二孢叶枯病以来，各国研究人员便对其检测技术进行研究。传统的检测方法是从病残体或带病种子分离菌体，将其接种在相应培养基上，于适宜温度培养数天，再对这些菌体的形态进行观察。若产孢则继续观察分生孢子的形态特征，从菌落上挑片镜检，观察菌丝、分生孢子、分生孢子梗等形态。从而确定是否存在鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei引起的病害。传统的检测方法不仅操作繁琐、费时，而且要求有高度的 专业知识，最重要一点是它不能满足病害防治中制定最佳防治时期及海关进出境快速检测和鉴定的需求。基因芯片技术虽然能够同时进行多种真菌的鉴定，但成本高，制约了其发展；杂交方式固有的局限性影响了其特异性；质谱技术以其快速准确的优点被用于微生物鉴定，由于质谱鉴定必须是培养后分纯的单克隆菌落，而且设备昂贵，操作难度高，因此，限制了其应用。随着生物学技术的发展，基于rDNA-1TS的长度多态性和序列多态性的序列分析，由于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息用来反应生物亲缘关系与分类情况，因而成为真菌分类及鉴定研究的热点，目前已广泛应用于真菌的属种间及种内组群水平的系统学研究。真菌核糖体DNA(rDNA)上的保守序列广泛，有着不同的进化水平的区域序列，可用于不同等级的真菌分类鉴定。核糖体DNA上的内转录间隔区ITS是存在于18S rDNA,5.8S rDNA和28S rDNA之间的区域，该区域受外界环境因素的影响小，与编码区相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，可以为真菌学的研究提供丰富的遗传信息。因此，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏快速分子检测的成功例子已越来越多。国内外有学者利用基于ITS碱基序列设计引物对真菌的分子检测开展研究，但针对Ascochyta rabiei的研究尚少。因此要对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei进行高特异性检测，从病原菌ITS碱基序列设计高特异引物并建立一种快速检测的体系及试剂盒是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌的生物学检测方法所需周期长、准确度低等问题，提供一种，该试剂盒包括A液(PCR反应液):含染料的2XTaq PCR MasterMix、上游引物7-5f (20 μ Μ)、下游引物7-5r (20 μ Μ)、超纯水；Β液(阳性对照)为鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌标准株DNA。采用利用该试剂盒在鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原真菌DNA、鹰嘴豆壳二孢叶枯病病残体、带病土壤及带病种子中均能特异地扩增出片段长度为440bp的特异扩增产物的方法进行检测。本专利技术所述的试剂盒用于生产实践中被鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌感染的植物组织、土壤及种子的快速、灵敏、特异的检测，同时用于田间病害的早期监测，也可为海关进出口鹰嘴豆所携带的鹰嘴豆壳二孢叶枯病菌高灵敏快速分子检测和鉴定。利用鹰嘴豆壳二孢叶枯病真菌分子检测试剂盒进行检测，其结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高。该试剂盒还可用于带菌的植物组织、带菌土壤及带菌种子的高灵敏度快速分子检测，确定病害防治最佳时期具有十分重要的意义。本专利技术所述的一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的检测试剂盒，该试剂盒为:A液PCR反应液和B液阳性对照组成；其中A液为PCR反应液是由含染料的2 X Taq PCR MasterMix，上游引物7_5f20 μ M)，下游引物7-5r20yM，超纯水重量浓度> 99%组成；B液为阳性对照:鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌标准株DNA，DNA浓度为IOOng/ μ L。所述试剂盒中A液中的上游引物为7_5f25bp:5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 '，下游引物为 7_5r23bp:5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。所述试剂盒中A液中含染料的2XTaq PCR MasterMix中包含Taq DNA聚合酶0.05units/ μ L,氯化镁4mM,脱氧核酸三磷酸基质0.4mM,其中脱氧核酸三磷酸基质由dATP, dCTP，dGTP, dTTP四种脱氧核糖核酸组成，购自北京庄盟生物基因科技有限公司，货号为 ZT201-02，L0T#1BH09N。所述的鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的检测试剂盒的检测方法，按下列步骤进行:a、待检样品或真菌的DNA提取，采用常规真菌DNA提取方法；b、取步骤a所得DNA模板I μ L，A液24 μ L，进行PCR反应，PCR反应条件:温度94°C预变性5min，温度94。。，变性50s，温度57.5°C，退火50s，72延伸2min，共30各循环，最后温度72°C，lOmin，温度4°C保存；c、将扩增产物于I %琼脂糖凝胶电泳检测。 本专利技术中针对特异检测鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的PCR引物，即特异分子检测引物的序列为:上游引物7-5f(25bp):5/ -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3'下游引物7-5r(23bp):5/ -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'；该引物由下载GenBank已公开报道Ascochyta rabiei的同属其它ITS序列，登录号分别为 AY152550, DQ822479, DQ822480, EU167600, FJ032643, HQ700312, JF714463，将其与测得的鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的ITS序列利用DNAMAN软件进行比较(附图说明图1)，选定特有的一段保守序列，即ITS序列的l-440bp，并根据其利用primerf.0软件设计一对针对鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌Ascochyta rabiei的特异引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒为：A液PCR反应液和B液阳性对照组成；其中A液为PCR反应液，由含染料的2×Taq?PCR?MasterMix，上游引物7?5f20μM，下游引物7?5r20μM，超纯水重量浓度≥99％组成；B液为阳性对照：鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌标准株DNA，DNA浓度为100ng/μL。
【技术特征摘要】
1.一种鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒为A液PCR反应液和B液阳性对照组成；其中 A液为PCR反应液，由含染料的2XTaq PCR MasterMix，上游引物7_5f20 μ M，下游引物7-5r20yM，超纯水重量浓度> 99%组成； B液为阳性对照鹰嘴豆壳二孢叶枯病病原菌标准株DNA，DNA浓度为IOOng/ μ L。2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于A液中的上游引物为7-5f25bp 5 ' -CCCGCTACCTCTTACCCATGTCTTT-3 '，下游引物为 7_5r23bp 5' -GTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGA-3'。3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于A液中含染料的2XTaqPCR MasterMix中包含Taq D...
【专利技术属性】
技术研发人员：马德英，马丽娟，羌松，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：
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